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蛋白酶(Protease,PR)抑制剂(Protease inhibitor,PI)类药物是针对获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy,HAART)所选用的两类药物之一。然而,人类免疫缺陷病毒(HIV)PR对PI类药物的耐药突变已经严重阻碍了抗病毒治疗。因此需要更多更好的PI类药物用于治疗。现有的PI类药物筛选模型主要通过检测待筛药物对HIV PR切割PR靶序列的抑制作用来鉴定该待筛药物是否可用实际应用,然而由于HIV PR对不同靶序列具有不同的切割活性,在针对耐药突变PR的PI类药物筛选中,需要根据不同的耐药突变PR选择与之适应的PR靶位点来进行筛选,而对于目前出现的多种耐药突变PR,由于其最适应的PR靶序列并未明确,所以现有方法难以应对耐药突变PR进行有效的PI类药物筛选。 为此,我们尝试利用耐药突变PR切割展示PR靶序列随机突变的噬菌体文库,从中筛选对耐药突变PR高敏感性的PR靶序列,以用于针对耐药突变PR的PI类药物筛选。同时,利用展示耐药突变PR敏感的PR靶序列的噬菌体,结合耐药突变PR,可以直接针对耐药突变PR进行PI类药物筛选。 一.HIV-1型HXB2株PR在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定 表达HIV PR是筛选敏感的PR靶序列的前提,为此我们选择了HIV-1 M组B亚型的代表HXB2株PR进行表达、纯化及鉴定。 根据HIV-1 HXB2株PR DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1PR的DNA编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,序列测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。将HIV-1 PR DNA克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中进行诱导表达,表达出相对分子质量为14000的HIV-1 PR蛋白,用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,纯化的目的蛋白浓度为7.74mg/ml,用HIV阳性血清进行免疫反应性的鉴定,证实该蛋白与HIV阳性血清呈特异性的反应性。获得了具有免疫学活性的HIV-1 PR。 二.HIV-1蛋白酶靶位点P2/NC序列的随机化文库的构建及切割筛选 构建适合的大容量生物大分子变异体文库是进行体外分子进化研究的关