论文部分内容阅读
绒山羊的绒毛具有较高的经济价值,毛囊性状对绒毛产量和品质有十分重要的影响。近年来,有关绒山羊毛囊周期性生长的分子调控机理取得较大的研究进展,但毛囊在胚胎期启动、生长发育过程的分子调控机理相关研究还相对匮乏。目前,生命科学研究进入了后基因组时代,转录组学和蛋白质组学是功能基因组学研究的重要内容,同时也为研究毛囊生长发育分子作用机制提供了很好的途径。本研究采集了绒山羊10个不同时期的胎儿皮肤,根据前期研究结果对45天(d)、55天(d)和65天(d)的绒山羊胎儿(E45,E55和E65)体侧皮肤(相同时期的3个样本作为生物学重复)进行了转录组和蛋白组测序,分别采用荧光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot, WB)对测序结果进行了验证,并对两组学数据联合分析发掘与绒山羊胚胎期毛囊启动、生长发育相关的基因、蛋白,为研究绒山羊胎儿期毛囊发生、发育分子调控机理提供研究基础。主要研究结果如下:1.通过转录组测序共测得平均每个样品11G的转录组数据量,差异表达分析发现3个时期差异表达基因4581个,其中E55 vs.E45有1590个差异表达基因,E65 vs.E55有2442个差异表达基因,E65 vs.E45有3844个差异表达基因(P≤0.05)。qPCR随机检测了10个差异基因在E45,E55和E65的表达量,发现其中8个基因的表达结果和RNA-seq一致。2.通过K-means方法分析基因表达模式,发现3个时期的4581个差异基因可以分为10类,每一类基因在毛囊的发生发育过程中可能发挥相近的功能;基因表达谱聚类(Hierarchical clustering)分析,发现E55和E45表达谱相近。GO功能分析发现差异基因显著富集在细胞成分,分子功能和生物过程等方面(P<0.05)。KEGG通路分析发现部分差异基因注释在WNT、TGFβ和ECM受体相互作用等通路中,存在于这些通路的重要差异基因可作为绒山羊毛囊发生、发育关键候选基因。通过高通量测序分析了3个时期9个样品的可变剪接类型,包括A5SS, A3SS, ES和IR,其中最普遍的剪切事件为IR。3.检测毛囊生长发育的关键候选基因SFRP4, WNT3, WNT10a和APC2在胎儿期10个不同阶段的表达模式,发现这4个基因在E45,E55和E65的表达与RNA-seq一致,进一步验证了RNA-seq结果准确性的同时,初步探讨了Wnt转导通路差异基因在绒山羊毛囊在胚胎期启动、生长发育过程可能发挥的作用。4.通过ITRAQ鉴定到E45,E55和E653个时期胎儿皮肤共有蛋白质1172个,差异蛋白质378个,其中E55 vs.E45有143个差异蛋白质,E65 vs. E55有176个差异蛋白,E65 vs.E45有201个差异蛋白(P<0.05)。利用WB技术检测Decorin蛋白在E45,E55和E65的表达,结果与ITRAQ一致。5.GO富集分析发现,差异蛋白在属于细胞过程、代谢过程和生物学调节等的生物学过程中富集;分子功能属性上,在结合和催化活性等过程富集;细胞组分属性上,在细胞和细胞器富集较多差异蛋白质。KEGG分析发现部分差异蛋白质注释到ECMR interaction, Focal adhesion, PI3K-Akt, MAPK, TGF-beta, VEGF、WNT和p53等信号通路中。用Cluser 3.0对随着胎儿发育表达量显著差异质的188个蛋白进行聚类分析(P<0.05),发现其中159个差异蛋白质表现出3种明显的变化趋势,其中63个蛋白质在整个检测时期持续上升,45个蛋白质持续下降及50个蛋白质呈先上升后下降趋势。6.转录组和蛋白组数据联合分析发现后两个时期共同差异上调基因238个,下调表达基因920个,胎儿55~65天发育阶段比胎儿45~55天发育阶段差异上调表达585个基因,下调表达1348个差异基因。发现后两个时期共同差异上调蛋白31个,下调表达蛋白28个,胎儿55~65天发育阶段比胎儿45~55天发育阶段差异上调表达69个蛋白,下调表达96个差异蛋白。其中,部分基因如DCN,KRT7, OXCT1, MYH10和ANPEP等的RNA-seq和ITRAQ测序数据在3个胎儿时期中的变化趋势一致。7.对Decorin(DCN)在绒山羊胎儿皮肤10个时期的mRNA和蛋白的表达谱进行研究。发现Decorin(DCN)在mRNA和蛋白水平上都是45天,55天和65天时表现持续上调趋势,75天,95天和105天皮肤中表达量相对其他胎儿时期较高,115天,125天和135天的表达量出现下降趋势。8.为后期从细胞水平研究DCN基因的作用机制,构建过表达载体pEGFP-CI/DCN。