目的：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)是构成先天性免疫系统的重要细胞，不需要预先刺激即可产生快速免疫应答，是人体抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。但新的研究发现，通常被认为是先天免疫细胞的NK细胞，也可以表现出适应性免疫的某些特征，例如更有效的二次刺激反应等功能，被认为可能具有特异性免疫应答，即免疫记忆功能。免疫记忆是针对二次免疫刺激，反应更强烈的现象。OlearyJ G等第一次观察到缺乏T细胞和B细胞的小鼠可以针对各种不同的半抗原诱导接触性超敏反应，提出NK细胞可以介导第二次相同半抗原刺激的特异性记忆应答;随后Berrien-ElliottMM等发现NK细胞可通过IL-12、IL-15和IL-18预刺激产生活化，几周以后再次用细胞因子刺激表现出增强的细胞功能，产生了免疫记忆反应;Dou Y等发现流感疫苗能够在感染六个月内引发NK细胞的记忆特性，并且NK细胞胞内NKP46的表达发生显著性增加，产生大量的IFN-γ; Reeves R K等在恒河猴中观察到感染猴免疫缺陷病毒后，NK细胞表现出抗原特异性记忆反应。人类免疫缺陷病毒感染人体后，是否存在NK细胞的免疫记忆现象，NK细胞表面受体的表达如何，至今尚无报道。本研究利用HIV感染者队列，研究HIV感染者是否存在HIV特异性NK细胞特异性免疫反应，探索与特异性免疫应答相关的NK细胞表面标志，检测HIV感染者队列与NK细胞特异性免疫应答相关的受体表达情况，并分析NK特异性免疫应答与HIV疾病进展的关系。　　方法：⑴HIV感染者来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，均为男性，感染的HIV病毒亚型以CRF01 AE为主;HIV抗体阴性的正常人均为男性。⑵提取外周血单个核细胞，加入抗体CD3、CD14和CD19，阴选去除T细胞、B细胞和单核细胞，得到含有NK和DC的混合细胞群，加入刺激物HIV特异性蛋白GAG和ENV(2μg/ml)或者HIV特异性多肽Gag（2μg/ml），5％ CO2，37℃温箱，孵育18h，检测NK细胞IFN-γ分泌。⑶NK和树突状细胞(Dendritic cells，DCs)的混合细胞群与刺激物共同孵育12h，加入GolgiStop再孵育6h收细胞，进行细胞表面染色CD3-Percp、CD56-PE-Cy7;用IFN-γ-APC进行胞内染色，加入200ul1％多聚甲醛溶液固定，使用流式细胞仪FACS LSRⅡ检测IFN-γ，采用BD FACS DivaTM软件进行分析。⑷含有NK和DC细胞的混合细胞群，加入阻断抗体NKG2A和NKG2C，1h后加入刺激物HIV特异性蛋白GAG和ENV(2μg/ml)或者HIV特异性多肽Gag（2μg/ml），5％ CO2，37℃温箱，孵育18h，检测NK细胞IFN-γ分泌。⑸向100μl全血加入溶血素去除红细胞，加CD3-Percp、CD56-PE-Cy7、CD57-PE、NKG2A-PE、NKG2C-APC表面染色，流式细胞仪FACS LSRⅡ检测NKG2C、CD57和NKG2A的表达情况。⑹将20μl BD公司CD4-FITC、CD8-PE和CD3-PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血，室温避光15 min，加入1×免洗溶血素450μl，室温避光15 min，应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，MultiSET软件分析结果，得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。⑺应用SPSS20.0软件包进行统计分析，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann—Whitney U检验，三组间实验指标的比较采用Kruskal-Wallis检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。　　结果：①取HIV感染者和正常人外周血，经过分离去除了T细胞、B细胞和单核细胞，得到含有NK和DC细胞的混合细胞群，分别加入HIV特异性蛋白GAG和ENV刺激18 h，检测NK细胞产生的IFN-γ，发现HIV感染者组NK细胞产生的IFN-γ显著高于正常人组(P=0.010)。②取HIV感染者和正常人外周血，经过分离去除了T细胞、B细胞和单核细胞，得到含有NK和DC细胞的混合细胞群，分别加入HIV特异性多肽Gag刺激18h，检测NK细胞产生的IFN-γ，发现HIV感染者组NK细胞产生的IFN-γ显著高于正常人组(P=0.029)。③取HIV感染者和正常人外周血，经过分离去除了T细胞、B细胞和单核细胞，得到含有NK和DC的混合细胞群，分别加入PMA和离子霉素刺激18h，检测NK细胞产生的IFN-γ，发现HIV感染者组NK细胞产生的IFN-γ和正常人组比较无统计学差异。④取HIV特异性蛋白GAG和ENV，分别刺激HIV感染者外周血NK细胞6h、12 h、18h和24 h，检测NK细胞产生IFN-γ的量，可知当HIV特异性蛋白GAG和ENV刺激时间为18h，NK细胞产生的IFN-γ明显增多。⑤选取含有NK和DC细胞的混合细胞群，加入5μl NKG2A和NKG2C封闭抗体，再加入HIV特异性蛋白刺激18h，检测NK细胞产生的IFN-γ，发现加入NKG2A和NKG2C封闭抗体后，NK细胞产生IFN-γ比不使用NKG2C和NKG2A抗体组有显著性降低(P=0.003，P=0.011)。⑥选取HIV感染者外周血，经过分离去除了T细胞、B细胞和单核细胞，得到含有NK和DC细胞的混合细胞群，分别加入不同浓度的NKG2A和NKG2C封闭抗体:0μg/μl、0.1μg/μl、0.5μg/μl和1.0μg/μl，再加入HIV特异性蛋白刺激18h，检测NK细胞产生的IFN-γ，发现加入1.0μg/μl NKG2A和NKG2C抗体时，抑制NK细胞产生IFN-γ效果好。⑦选取未治疗HIV感染者、治疗HIV感染者和健康对照者，检测外周血NK细胞NKG2C和NKG2A的表达，发现未治疗HIV感染者、治疗HIV感染者外周血NKG2C+ NK细胞比正常人明显增多(P=0.004，P=0.025)，而NKG2A+ NK细胞在三组之间无统计学差异。⑧选取未治疗HIV感染者、治疗HIV感染者和正常人，检测外周血NK细胞NKG2C和NKG2A分子，进行联合分析发现未治疗HIV感染者和治疗HIV感染者外周血NKG2C+NKG2A-NK细胞比正常人均明显增高(P=0.030，P=0.024)，同时，未治疗HIV感染者NKG2C+NKG2A+ NK细胞比正常人有明显增高(P=0.002)。⑨检测了HIV感染者外周血NK细胞表面NKG2A、NKG2C和CD57分子的表达，发现HIV感染者外周血NKG2A+ NK细胞与CD4+T淋巴细胞计数成正相关(P=0.045，r=0.442)，而NKG2C+ NK细胞、CD57+ NK细胞与CD4+T淋巴细胞计数无统计学相关性。⑩根据CD4+T淋巴细胞计数高低将HIV感染者分为小于350细胞/微升和大于350细胞/微升两组，研究发现:CD4+ T淋巴细胞计数大于350细胞/微升的HIV感染者外周血NKG2C+NKG2A+ NK细胞比CD4+T淋巴细胞计数小于350细胞/微升的HIV感染者更高(P=0.043)，而NKG2C+CD57+ NK细胞在不同CD4+T淋巴细胞计数分组比较中无统计学差异。　　结论：⑴HIV感染者外周血NK细胞具有特异性免疫应答现象。⑵NK细胞的特异性免疫应答反应需要NKG2A和NKG2C分子的参与。⑶CD4+T淋巴细胞计数大于350细胞/微升的HIV感染者，外周血免疫特异性免疫反应相关分子NKG2C+NKG2A+ NK细胞比CD4+T淋巴细胞计数小于350细胞/微升的HIV感染者更高。