非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）是最常见的血液系统恶性肿瘤,弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的NHL亚型,占成人初治NHL的40%以上。虽然以利妥昔单抗联合化疗为基础的一线治疗方案显著地改善了 DLBCL患者的预后,但是仍有40%左右患者难以得到理想的临床疗效,发生耐药或复发。尽管二线治疗和挽救性治疗对部分复发/难治DLBCL患者有效,但是由于DLBCL的异质性,仍有部分患者出现疾病复发或进展,并最终死亡。因此,寻找DLBCL的特异性分子标志物和信号传导通路,寻找有效的靶向治疗手段具有重要的临床意义。白细胞分化抗原47（Cluster of differentiation 47,CD47）是免疫球蛋白超家族的成员,又被称为整合素相关蛋白（Integrin-associatedprotein,IAP）。CD47广泛表达于几乎所有细胞,通常在肿瘤细胞上高表达。CD47与表达于固有免疫细胞,特别是巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（Signal-regulatoryproteinalpha,SIRP-α）结合,激活“don’t eat me”的免疫抑制信号通路,抑制固有免疫细胞的吞噬功能,介导肿瘤细胞的免疫逃逸。因此,CD47被认为是肿瘤免疫治疗的一个新靶点。近年来研究发现,利用CD47抗体阻断CD47-SIRP-α相互作用,在多种肿瘤中取得了令人满意的结果。在DLBCL的治疗中,一项CD47抗体的早期临床试验采用人源化CD47抗体Hu5F9-G4联合利妥昔单抗治疗复发/难治DLBCL患者,结果显示15名复发/难治DLBCL患者中6人获得了部分或完全缓解。但是,由于样本量过小等问题CD47抗体在DLBCL中的实际临床疗效需要后续研究结果来证实。尽管CD47靶向治疗DLBCL已有10余年研究历史,但是CD47在DLBCL发生发展中的作用及新的CD47靶向药物等诸多问题值得进一步深入研究。盐酸小檗碱,俗称黄连素,是中药黄连的主要有效成分。盐酸小檗碱是一种季胺型异喹啉类生物碱,化学结构稳定,在临床上广泛应用于肠道感染,近年来研究发现盐酸小檗碱在治疗糖尿病、心血管疾病以及抗肿瘤等方面具有良好的应用前景。研究发现,盐酸小檗碱在结直肠癌、食管癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌和白血病等多种肿瘤中具有抗肿瘤活性。盐酸小檗碱通过诱导细胞衰老、细胞凋亡,介导细胞周期阻滞,调控细胞自噬和表观遗传学改变等机制发挥抗肿瘤作用。除此之外,盐酸小檗碱与5-氟尿嘧啶、阿霉素、他莫昔芬、索拉非尼等药物联用具有协同增效作用,可以增强化疗药物的抗肿瘤作用。但是既往研究主要探讨盐酸小檗碱在实体瘤中的抗肿瘤作用,鲜有研究探索盐酸小檗碱在淋巴瘤中的抗肿瘤机制,且较少有研究探讨盐酸小檗碱对于肿瘤免疫逃逸的调控作用。本研究主要探索CD47在弥漫大B细胞淋巴瘤发生发展中的生物学作用,探讨盐酸小檗碱调控CD47表达的生物学功能及作用机制。第一部分 CD47在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及生物学功能目的:弥漫大B细胞淋巴瘤是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,具有高度异质性。CD20单抗的应用极大地改善了 DLBCL的治疗效果,但是仍有40%的患者在标准一线治疗后得不到良好的临床缓解进展为复发/难治DLBCL。因此,深入探究DLBCL发生发展中的分子调控机制,探寻新的分子治疗靶点和治疗策略对于改善DLBCL的预后具有重要意义。既往研究发现,CD47过表达于多种肿瘤细胞表面,通过与表达于巨噬细胞表面的SIRP-α相互作用激活“don’t eat me”的免疫抑制信号通路,介导肿瘤细胞的免疫逃逸。CD47表达水平与乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌等多种肿瘤的不良预后显著相关,但CD47表达水平与DLBCL预后的相关性尚不明确。本研究旨在揭示CD47在DLBCL中的表达水平及其临床应用价值,探究CD47在DLBCL免疫逃逸中的作用,为下一步以CD47为靶点的抗肿瘤研究提供理论基础。材料与方法:1 初治 DLBCL 患者和反应性淋巴炎（Reactive hyperplasia lymphoid,RHL）患者标本获取及免疫组织化学染色;2 患者临床信息获取及生存分析;3 DLBCL细胞株及细胞培养;4 获取健康人外周血和利用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）;5 流式细胞术;6 RNA提取、逆转录cDNA和实时定量荧光PCR（RT-qPCR）;7 细胞总蛋白提取及蛋白免疫印迹电泳（western-blot）;8 siRNA合成与细胞转染;9 慢病毒载体介导CD47低表达;10人外周血CD14阳性单核细胞分选及巨噬细胞诱导;1 1 人DLBCL细胞CFSE标记;12巨噬细胞和DLBCL细胞共培养及吞噬功能检测;13数据统计学分析。结果:1 采用免疫组化方法检测55例DLBCL患者及40例RHL患者石蜡切片中CD47表达水平。结果显示,CD47定位于DLBCL细胞膜,且DLBCL患者CD47表达水平高于RHL患者。DLBCL患者中CD47阳性患者占54.55%（30/55）,而 RHL 患者中 CD47 阳性患者占 27.50%（11/40,P＜0.05）。2 55例DLBCL患者中随访到38人,统计其临床指标包括年龄、性别、NCCN IPI评分、Ann Abor分期、亚型以及血清乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）水平。相关性分析结果显示,CD47表达水平与DLBCL亚型显著相关（P=0.007）:CD47阳性患者主要为non-GCB型。CD47表达水平与其他临床指标无显著相关性。Kaplan-Meier生存分析结果示,与CD47阴性患者相比CD47阳性患者具有相对差的OS。3 采用免疫组化检测38例随访DLBCL患者石蜡切片CD68表达水平,计数高倍视野下CD68阳性巨噬细胞数。结果显示,CD68阳性巨噬细胞计数与患者年龄、性别、NCCN-IPI评分、亚型、Ann Abor分期以及血清LDH水平等临床指标无相关性。Kaplan-Meier生存分析结果显示,CD68阳性细胞计数与患者OS无显著相关性。4 联合CD47表达水平和CD68阳性细胞数可将38例DLBCL患者分为4组:CD47negative/CD68high,CD47negative/CD68low,CD47positive/CD68low 和CD47positive/CD68low,Kaplan-Meier生存分析结果显示,4个亚组中CD47positive/CD68low患者具有相对更差的预后。5 经流式细胞术和western-blot分别检测细胞表面和细胞总蛋白中CD47表达情况。结果显示,与对照相比,DLBCL细胞系LY1、LY3、LY8、Val及U2932中CD47表达水平显著升高。6 采用3个不同序列的CD47 siRNA转染DLBCL细胞系LY1、LY8和U2932,利用western-blot检测CD47敲减效率,结果显示转染3个CD47 siRNA均可降低CD47蛋白表达水平。选择敲减效率最高的CD47 siRNA序列构建慢病毒载体。慢病毒转染LY1、LY8和U2932细胞构建稳定低表达CD47（shCD47）DLBCL 细胞及其阴性对照（shControl）DLBCL 细胞。RT-qPCR和western-blot检测DLBCL细胞CD47敲减效率,结果显示,与转染shControl细胞相比,转染shCD47的LY1、LY8和U2932细胞CD47 mRNA及蛋白表达水平明显下降。7 利用人CD14阳性细胞分选试剂盒分离健康人PBMCs中CD14阳性细胞,通过 100ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）诱导其分化为巨噬细胞。转染shControl及shCD47的LY1、LY8或U2932细胞与巨噬细胞共培养,结果显示,巨噬细胞对CD47低表达DLBCL细胞的吞噬明显增加。在LY1、LY8或U2932与巨噬细胞共培养体系中,用CD47单抗B6H12或其同型对照免疫球蛋白处理DLBCL细胞,结果显示与同型对照免疫球蛋白相比,B6H12处理可以增强巨噬细胞对DLBCL细胞的吞噬。结论:1 CD47在DLBCL患者组织中高表达,CD47蛋白表达水平与DLBCL患者亚型显著相关,CD47阳性患者具有相对更差的预后。DLBCL患者组织切片中CD68阳性巨噬细胞数与患者年龄、性别、NCCN IPI评分、亚型、Ann Abor分期以及血清LDH水平等临床指标及预后均无相关性。联合CD47表达水平和CD68阳性细胞数可对DLBCL患者进行亚组分析,其中CD47positive/CD68low亚组患者具有相对更差的预后。综上所述,CD47可以作为DLBCL的潜在生物学标记物,联合CD47及CD68有望成为新的DLBCL预后预测模型。2 DLBCL细胞系高表达CD47,慢病毒介导的CD47敲减或CD47单抗处理均可增强巨噬细胞对DLBCL细胞的吞噬,CD47介导DLBCL细胞免疫逃逸巨噬细胞吞噬作用。第二部分盐酸小檗碱靶向CD47在弥漫大B细胞淋巴瘤中发挥抗肿瘤作用目的:盐酸小檗碱具有广泛的抗肿瘤活性,可以通过促进肿瘤细胞衰老、凋亡、周期阻滞,调控肿瘤细胞自噬、焦亡等途径抑制肿瘤细胞增殖和转移。基于上述抗肿瘤机制盐酸小檗碱可以在多种肿瘤细胞中起到放疗增敏作用,也可增强5-氟尿嘧啶、多柔比星、他莫昔芬、索拉非尼等化疗药物的抗肿瘤效应。最近研究发现,在肺癌中,盐酸小檗碱可以通过调控PD-L1的表达发挥免疫调节作用,显示了盐酸小檗碱在免疫调控中的应用潜能。但是既往研究主要探讨盐酸小檗碱在实体瘤中的抗肿瘤作用,少有研究揭示盐酸小檗碱在淋巴瘤中的生物学功能,且尚未有研究探讨盐酸小檗碱对固有免疫检查点蛋白CD47的调控。为了探究盐酸小檗碱对CD47的调控机制及生物学功能,本研究用盐酸小檗碱处理DLBCL细胞,探究盐酸小檗碱调控CD47的分子机制,在共培养体系中探讨盐酸小檗碱对巨噬细胞吞噬功能的作用,在荷瘤小鼠模型中探究盐酸小檗碱对肿瘤生长的影响。基于上述研究内容,本研究进一步探索盐酸小檗碱对利妥昔单抗和CD47单抗的增效作用。材料与方法:1 人DLBCL细胞系及小鼠B细胞淋巴瘤细胞系的培养及药物处理;2 CCK8检测细胞活性;3 流式细胞术;4 RNA提取、逆转录cDNA和RT-qPCR;5 蛋白提取及western-blot;6 小鼠腹腔巨噬细胞获取;7 人外周血CD14阳性单核细胞分选及巨噬细胞诱导;8 淋巴瘤细胞CFSE标记;9 巨噬细胞和淋巴瘤细胞共培养及吞噬功能检测;10慢病毒介导c-myc过表达;1 1荷瘤小鼠模型建立及盐酸小檗碱灌胃;12冰冻切片制备及免疫荧光染色;13数据统计分析。结果:1 CCK8结果显示,盐酸小檗碱抑制DLBCL细胞株LY1、LY8和U2932的增殖活性,且具有剂量依赖性。3种细胞株在48h时的半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration,IC50）分别为:LY1 细胞 46.07μM,LY8细胞 40.40μM,U2932 细胞 42.27μM。2 流式细胞术和western-blot结果显示,30μM盐酸小檗碱处理LY1、LY8和U2932细胞可诱导CD47表达下降且呈时间依赖性。30μM盐酸小檗碱预处理的LY1、LY8和U2932细胞与巨噬细胞共培养,盐酸小檗碱处理可增强巨噬细胞对DLBCL细胞的吞噬。3 30μM盐酸小檗碱下调小鼠B细胞淋巴瘤细胞株A20细胞CD47的表达,且具有时间依赖性。30μM盐酸小檗碱预处理A20细胞与小鼠腹腔巨噬细胞共培养,结果显示盐酸小檗碱可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬A20细胞。免疫完全小鼠BALB/c小鼠皮下接种A20细胞构建荷瘤小鼠模型,给予盐酸小檗碱（实验组）或羧甲基纤维素钠溶液（对照组）灌胃给药处理,记录小鼠肿瘤生长曲线。结果显示,与对照组相比,盐酸小檗碱可以明显抑制肿瘤增长速度和肿瘤重量。肿瘤组织冰冻切片的免疫荧光染色结果显示,实验组肿瘤组织CD47表达降低,且F4/80（小鼠巨噬细胞标志蛋白）阳性巨噬细胞数量明显增加。4 RT-qPCR结果显示,盐酸小檗碱下调LY1、LY8和U2932细胞CD47 mRNA的表达。Western-blot结果显示,在LY1细胞中盐酸小檗碱下调CD47表达同时,也下调CD47转录因子c-myc的表达。应用c-myc抑制剂10058-F4处理LY1细胞后,CD47表达下降;慢病毒载体诱导LY1细胞c-myc过表达后,CD47表达上升。本研究进一步采用盐酸小檗碱处理c-myc过表达的LY1细胞,western-blot结果显示盐酸小檗碱可部分回复c-myc过表达诱导的CD47上调。5 LY1、LY8、U2932细胞与巨噬细胞共培养体系中联合应用盐酸小檗碱和CD47单抗B6H12或联合应用盐酸小檗碱和CD20单抗（利妥昔单抗）。结果显示与单药相比,联合用药可提高巨噬细胞对DLBCL细胞的吞噬。结论:盐酸小檗碱可通过调控CD47转录因子c-myc的表达抑制DLBCL细胞CD47的表达,增加巨噬细胞对DLBCL细胞的吞噬。体内实验中,盐酸小檗碱可以抑制CD47表达,促进肿瘤内巨噬细胞浸润,并抑制肿瘤生长。盐酸小檗碱对CD47单抗及利妥昔单抗介导的巨噬细胞吞噬功能有增效作用。本研究揭示了盐酸小檗碱新的抗肿瘤作用机制,为DLBCL的治疗提供了新思路。