尽管免疫抑制剂的发展使器官移植取得了很大的进步,移植后急性排斥反应仍是肝移植术后的主要障碍之一,长期大量使用免疫抑制剂对各器官远期功能不利已经成为共识,维持什么水平的免疫抑制甚至是否撤除免疫抑制以及何时撤除免疫抑制?这些问题的解决必须建立在对排斥机制、预测排斥发生的特异性指标和影响排斥反应的因素等充分了解的基础上。因为细胞毒性T淋巴细胞在抑制病毒感染、抗肿瘤、急性同种移植排斥反应等免疫应答中起主要作用,而我国接受肝移植的病人大多为乙肝患者,乙肝阳性肝移植病人外周血存在的HBV特异性CTL是否对急性排斥的发生有所影响,本课题对此做了初步研究。(一)HBV-DNA与肝移植术后急性排斥反应关系的临床研究对第二军医大学附属东方肝胆外科医院在2003年4月至2005年10月间因乙肝相关性肝病(HBsAg阳性)实施同种异体原位肝移植术的160例病例进行分组及统计分析。围手术处理均按医院标准的处理方案,急性排斥(acute rejection, AR)的诊断根据是按1995年banff国际会议纲要制定的标准,肝穿的组织病理检查分别按banff分级计分。23例病人发生AR,排斥发生率14.38%。根据术前患者的HBV-DNA的水平,分为A组26例(未检出)、B组68例(<105拷贝)、C组66例(≧105拷贝),其中A组2例,B组6例,C组15例发生排斥。X2检验分析各组的AR发生率的差异,结果表明:AR发生率C组>B组>A组;三组之间AR的发生率有显著差异;在B组和C组之间有显著性差异。提示术前高水平的病毒载荷和术后急性排斥反应的发生具有相关性,载荷高者排斥反应发生率高。(二)构建检测HBV特异性CTL的单链MHC-肽四聚体因细胞毒性T淋巴细胞在抑制病毒感染和急性同种移植排斥反应等免疫应答中起主要作用。因此,了解体内抗原特异性的CTL数量和状态有极其重要意义。但由于体内抗原特异性CTL的频度很低,通常不到CD8+总数的1%,传统定量方法操作繁琐且准确率不高。四聚体染色(tetramer-staining)技术是最近几年发展起来的灵敏度最高、操作相对比较简单的抗原特异性CTL检测方法。T细胞识别抗原有MHC限制性,HLA-A0201是我国人群中出现频率最高的HLAI类基因,实验中,我们选择构建HLA-A0201四聚体以筛查广泛人群;采用基因工程合成技术,通过一段柔性序列把MHC轻链β2 m的C端和MHC重链分子HLAA0201胞外区N端相连,并在HLA分子胞外区C端连上15aa的BSP得到重组单链MHC分子,以包涵体形式表达后在HLA限制性表位肽存在下重折叠得到MHC-抗原肽复合物,生物素化后利用亲合素和生物素的特异性结合,用荧光标记的亲合素鳌合四个复合物分子,成功构建获得能在流式细胞仪上用于检测的四聚体,并验证了它的生物学有效性。现有的研究已证实乙肝病人外周血中病毒特异性的CTL数量随病情严重程度和病程变化而改变,并且不同抗原特异的CTL数量不同。在本实验中我们选择分别来自HBV表达的四种蛋白(核心蛋白HBC,多聚酶蛋白HBP,外膜蛋白HBS,X蛋白HBX)的抗原肽构建成了四种四聚体,以期检测时能全面反映病人体内HBV特异性CTL的水平。其中含HBX表位肽的四聚体之前未见报道。(三)HBV阳性肝移植病人外周血中HBV特异性CTL的频度与急性排斥的相关性研究HBV-DNA是反映病毒复制的特异性标志,在一定范围内HBV-DNA的数量和病毒特异性CTL数量相关。病例回顾已提示病毒载荷升高病人急性排斥率上升,可以推测病毒特异性CTL可能对急性排斥有所作用。为证实这一推测,我们利用四聚体技术检测了手术及排斥反应前后病人CTL的数量。在对东方肝胆医院胆道二科51例接受肝移植治疗的HBV阳性肝移植病人筛查后,其中HLA-A2+的18例病人入选实验。分别测定移植术前一天和术后第12天时病人外周血中针对HBV表达四种蛋白的特异性CTL的数量。实验结果显示,移植病人存在针对多种抗原的CTL,术前整体HBV特异性CTL数量不高,和文献报道慢性乙肝病人特异性CTL数量基本一致。Mann-Whitney U检验表明,不同病毒载荷组病人之间CTL总数无统计学差异,可能和病毒各抗原、免疫原性的不同以及免疫耐受有关。Wilcoxon signed ranks Z检验显示移植术后CTL总数和术前相比有显著性差异,符合免疫抑制剂的作用。在18例入选病人中3例发生经实验室检查和病理活检证实的急性排斥。Mann-Whitney U检验表明排斥病人的术前CTL数量与未发生排斥病人比有显著差异,提示HBV特异性CTL的数量和急性排斥发生有一定关系。