前言:鼻咽癌(NPC)是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,按其发病率排在常见癌症的第24位,70%的鼻咽癌新发病例均出现在东亚和东南亚地区,尤其是我国南方,如中国广东、广西、湖南、福建、江西、香港地区为鼻咽癌的高发区,男性的发病率一般是高于女性的2-3倍,40-50岁为高发的年龄段。由于患者鼻咽部的恶性肿瘤位置较隐匿,导致其早期临床症状不典型,约70%的患者在被确诊时己是Ⅲ期或Ⅳ期。此外,鼻咽癌大部分患者属于低分化或未完全分化的鳞状上皮细胞癌,恶性程度较高,容易在鼻咽部以外出现远处肿瘤转移。NCCN指南推荐同步放化疗和辅助放化疗或诱导化疗后同步放化疗作为治疗手段。据统计几乎98%的NPC与EBV密切相关,其中EBV的潜伏膜蛋白1(LMP1)在控制和促进鼻咽癌的发生、发展的细胞分化过程中己经被证实起到了重要的作用。它能通过鼻咽癌细胞内多种信号直接传导细胞通路,如TRAFs&NF-κB、PI3K-A kt/PK B、MAPK、转运蛋白PRA1等,调节和控制鼻咽癌细胞的正常增殖、生长、迁移、分化、免疫与细胞凋亡,从而控制癌变细胞的发生和发展。对于LMP1的鼻咽癌最新的研究结果表明,miR-155在体外能够促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但对于鼻咽癌细胞放疗的影响尚不清楚;而高迁移率族蛋白B1(HMGB1)最近被发现在人鼻咽癌组织中过表达,而且其表达的高低与患者的总生存期和无病生存期有关,且关于促进HMGB1的机制以及促进的HMGB1在NPC中的作用却知之甚少;此外,循环肿瘤细胞(CTC)及EBVDNA和RNA作为鼻咽癌的一个有前途的生物标志物也不断的被重视起来,但这几种标志物与鼻咽癌的转移关系还没有研究。目的:为了进一步深入探讨EBV LMP1及其相关因子miR-155、HMGB1在鼻咽癌发生、发展的分子机制,分析EBV的DNA和RNA、CTC在鼻咽癌转移诊断中的作用,寻找基因治疗和判断鼻咽癌预后的分子靶标。我们首先设计和构建了 LMP1真核表达载体转染的鼻咽癌稳定细胞系,并评估LMP1对鼻咽癌细胞增殖、迁移的影响。通过检测LMP1转染的鼻咽癌细胞中miR-155的表达及miR-55基因抑制对鼻咽癌细胞放疗的敏感性,评估miR-155对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和体外放疗的影响,探讨miR-155与LMP1的相关性。通过检测人鼻咽癌标本及EBV感染的鼻咽癌细胞中HMGB1,评估LMP1对HMGB1的促进作用及HMGB1在体外对鼻咽癌细胞增殖的调控作用。检测鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA和RNA(LMP1、LMP2、BART和EBER1)水平,评估患者外周血液循环CTC细胞中EBVDNA、RNA与CTC和肿瘤转移之间的关系。方法:(1)构建重组LMP1表达载体,并对CNE-2细胞进行转染,之后以实时定量PCR法、蛋白印迹观察转染率及LMP1转录和蛋白表达水平的变化;对pEGFP-LMP1转染CNE-2鼻咽癌细胞进行克隆,CCK8检测细胞活性,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白印迹法对HMGB1和P65蛋白进行表达定量分析;之后采用qPCR测定LMP1过表达的CNE-2细胞中miR-155的转录水平;用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,并进行细胞侵袭实验判断miR-155对于鼻咽癌侵袭的影响;使用RNeasy Mini试剂盒从CNE-2细胞中分离并提取细胞总mRNA,使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取CNE-2细胞中的miRNA;CCK8检测miR-155模拟转染CNE-2细胞后的增殖情况,及使用miR-155抑制剂后的细胞增殖情况;测定miR-155抑制后的正常CNE-2细胞或CNE-2(LMP1)细胞在放疗下的存活率。(2)遵循知情原则,对84例鼻咽癌患者进行活检,血清学检查52例为EBV阳性,32例为EBV阴性,并记录了这些患者放疗或化疗前完整的临床资料。检测这些标本的HMGB1表达以及其与LMP1 DNA水平的关系。之后评估感染EBV的CNE-2细胞从细胞核向细胞质的转移和释放HMGB1的情况,测定HMGB1对CNE-2细胞的增殖影响,以及RAGE特异性siRNA转染对HMGB1在CNE-2细胞增殖中的作用。(3)遵循知情原则,收集250名鼻咽癌患者资料,其中伴有转移者136例,不伴有转移者114例,治疗前取外周静脉血,进行CTC计数,并采用实时定量PCR方法检测血浆LMP1、LMP2、BART和EBER1水平,评估DNA/RNA和肿瘤转移之间的关系。结果:(1)pEGFP-LMP1质粒转染CNE-2细胞后14天时,重组载体转染的LMP1蛋白表达明显高于对照组,pEGFP-LMP1真核载体构建成功;CCK8检测显示LMP1过表达的CNE-2细胞的增殖活性比对照组高,具有统计学差异;细胞划痕实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞在12h、24h时间点均大于对照组,有统计学差异,P<0.01;细胞侵袭实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞穿过胶膜的细胞数在12h、24h明显多于对照组,有统计学差异,P<0.01;LMP1过表达CNE-2细胞组HMGB1和P65蛋白表达均高于对照组,单因素方差分析均有统计学差异,分别为P=0.0058;P=0.02;比较miR-155在CNE-2与HONE1之间的转录水平,发现并无明显的统计学差异,P>0.05,但在LMP1过表达CNE-2细胞中miR-155的转录水平是CNE-2的4.5倍,P<0.001。采用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,miR-155转录水平分别增加11.22和11.63倍。细胞侵袭实验中,miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,24h后染色计数穿越基质膜的细胞数明显高于转染对照组的细胞越膜数量,统计学有显著差异,P<0.001。通过CCK-8检测,miR-155模拟转染可显著促进CNE-2细胞增殖,P<0.05。与miR-Con细胞相比,转染miR-155抑制剂显著降低了 CNE-2细胞中miR-155的水平P<0.05;P<0.01,细胞增殖也显著下降,P<0.05。在0或4.0Gy辐射处理后,转染miR-155抑制剂后,CNE-2(LMP1)细胞与转染miR-Con的细胞相比,形成的菌落更少,P<0.01。在转染了miR-155抑制剂的CNE-2(LMP1))细胞中比在转染了 miR-Con细胞中更显著,P<0.01。无论是否暴露于4.0Gy辐射,miR-155敲低对CNE-2(Con)细胞的集落数量减少不显著,P>0.05。(2)EBV阳性组的HMGB1蛋白水平也显著高于EBV阴性组(P<0.001)。HMGB1 mRNA水平与52个EBV阳性人样本中LMP1 DNA水平显著相关,R2=0.5640,P<0.0001。感染EBV的CNE-2细胞的上清液中的HMGB1在感染后12小时至48小时内也有显著的升高(P<0.05、P<0.01或P<0.001),大于0.5 mg/mL HMGB1的处理促进CNE-2细胞增殖(0.5、1、3 mg/mL HMGB1的P<0.05或P<0.01),且有剂量依赖性(P<0.05)。这种促进细胞增殖的作用也具有时间依赖性(治疗后36或48小时,P<0.05或P<0.01)。在60 nM转染siRNA-RAGE后,HMGB1促进CNE-2细胞的增殖被显著抑制(36 或 48 h 后,P<0.05 或P<0.01)。(3)转移组的平均CTC数值为显著高于非转移组,P<0.0001。转移性鼻咽癌患者血浆EBV DNA和RNA水平明显高于非转移性鼻咽癌患者。CTC、LMP1 DNA、BART或EBER1相对水平与肿瘤分期和结节分期均有显著相关性(R2>0.25,无论是肿瘤期还是淋巴结期,四种生物标志物)。结论:(1)pEGFP-LMP1的重组质粒能够有效地转染CNE-2细胞,并在CNE-2细胞中稳定表达。EBV LMP1在鼻咽癌发生、发展中起重要作用,其促进鼻咽癌增殖、侵袭和迁徙可能通过激活HMGB1/NF-kb信号途径完成。miR-155与EBV阳性鼻咽癌相关,其上调与LMP1相关,而miR-155在在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制miR-155可以使得鼻咽癌细胞对放疗更加敏感。(2)在体内或体外鼻咽癌组织中HMGB1均显著增高,HMGB1与鼻咽癌的恶性状态相关,EBV感染导致的LMP1高表达通过HMGB1/RAGE信号促进在鼻咽癌细胞体外增殖。(3)转移的鼻咽癌患者血中CTC、EBVDNA和RNA水平均明显升高。LMP1 DNA和EBER1 RNA与鼻咽癌转移具有相关性。