心力衰竭是一种复杂的临床症状群,是高血压、缺血性心肌病、心瓣膜病等众多心脏病的终末阶段,其发病率高、预后差,是世界性日趋严重的危害健康的主要问题。强心苷(Cardiotonic steroid,Cs)用于治疗慢性充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF)已有200多年历史,但其加强心肌收缩力的作用机制却一直是人们争论的焦点。一般认为:Cs治疗心衰是因为其抑制衰竭心肌细胞膜上的Na+, K+-ATP酶(NKA),使细胞内Na+增加,通过Na+/Ca2+交换,引起细胞内Ca2+的升高,并促进肌浆网对钙的摄取及随后的钙释放,使心肌收缩力随之增加。钠氢交换体(Na+/H+ exchanger,NHE)作为细胞膜上的一种交换糖蛋白转运体,其功能主要是调节细胞内pH值、细胞容积以及对多种不同激素和丝裂原作出应答。细胞内酸化变构激活NHE,以1:1的比例将胞外的钠离子与胞内的氢离子进行交换。NHE的活化导致Na+内流,依次活化多种亚型PKC,最终改变基因表达和蛋白合成,促进肥厚的发生。最近Baartscheer报道,诱导压力/容积超负荷而引发家兔心肌肥厚并具有心衰体征一个月后,连续饲服NHE-1抑制剂两个月,可复原已形成的心肌肥厚、心力衰竭和离子、电生理改变。Saini HK等报道,NHE在哇巴因诱导的心肌细胞胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的增加中发挥着重要作用。然而,NHE抑制剂甲基-N-异丁基氨氯吡咪(MIA)在哇巴因存在情况下,对离体缺血再灌注心脏的正性肌力作用与其对静息或KCl去极化的心肌细胞的[Ca2+]i作用不一致,因此很难解释NKA与NHE之间的相互作用及两者在病理情况下发挥作用的机制。本实验选用小鼠为研究对象,建立小鼠CHF模型,进一步观察在哇巴因存在或不存在情况下NHE抑制剂对小鼠正常(NC)和心衰心肌细胞(CHFC)的肌力作用和[Ca2+]i的影响,以探讨抑制NHE作为治疗心衰新方案的可能性。目的:通过建立小鼠慢性充血性心力衰竭动物模型,同步检测MIA在哇巴因(ouabian)存在下对慢性心衰所致小鼠心肌细胞收缩及钙瞬变的影响,检测CHF小鼠心肌细胞膜NKAα1、α2亚基和NHE-1蛋白表达的改变,以探讨NKA和NHE-1影响慢性心衰小鼠心肌细胞肌力作用的机制。方法:采用主动脉弓缩窄法建立小鼠CHF模型;以酶解法急性分离其左室心肌细胞,然后采用可视化单细胞动缘探测系统(Video-based motion edge-detection system)同步检测不同浓度OUA对单个小鼠心肌细胞舒张、收缩功能及钙瞬变的变化,并比较同一浓度OUA对正常和心衰小鼠的心肌细胞的变化。同步检测在OUA存在下,MIA对单个小鼠正常和衰竭心脏心肌细胞收缩力和钙瞬变的影响,并与单独使用MIA的作用进行比较。采用Western Blot方法检测小鼠NKAα1、α2亚基和NHE-1蛋白表达的改变。结果:⑴OUA对小鼠NC和CHFC收缩力和细胞内钙的作用。若将给药前细胞收缩幅度、钙瞬变幅度及胞浆基础钙离子浓度标准化为100%,则0.5μM,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1 mM的OUA使小鼠NC收缩幅度明显分别增大至(124.60±5.02)%、(133.02±5.65)%、(148.42±6.63)%、(174.14±6.29)%、(204.64±3.66)%、(228.50±10.87)%、(286.42±27.57)%和(288.80±23.82)%(p<0.01)。为探讨OUA对心肌细胞正性变力作用与Ca2+的关系,本研究同步检测了OUA对钙瞬变的影响。上述浓度的OUA可以使小鼠NC钙瞬变幅度分别增加为(119.26±4.30)%、(125.43±5.64)%、(126.10±6.77)%、(133.92±10.26)%、(139.72±6.43)%、(152.90±8.10)%、(157.38±11.53)%和(156.39±12.24)%(p<0.01);5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1 mM可以使小鼠NC胞浆基础钙离子浓度分别增加为(107.33±2.18)%、(110.82±2.32)%、(111.10±2.81)%、(112.24±2.56)%、(115.72±4.63)%和(116.70±3.80)%(p<0.01),但0.5μM,1μM OUA对NC胞浆基础钙离子浓度没有明显影响,分别为(103.64±2.26)%和(102.47±3.29)%(p>0.05);其中0.1μM OUA对细胞收缩幅度、钙瞬变幅度以及胞浆基础钙离子浓度均没有影响,分别为(104.59±2.35)%、(101.41±1.82)%和(99.62±2.23)%(p>0.05),而500μM和1 mM的OUA使NC很快出现毒性反应,表现为不规律收缩,细胞长度变短,甚至变为球形。而50μM的OUA使小鼠CHFC收缩幅度、钙瞬变幅度以及胞浆基础钙离子浓度分别明显增大至(351.71±90.6)%、(164.77±6.87)%和(117.67±7.70)%(p<0.01),较50μM OUA增加NC收缩幅度、钙瞬变幅度以及胞浆基础钙离子浓度的作用显著为强(p<0.01)。⑵MIA对小鼠NC和CHFC收缩力和细胞内钙的作用。灌流0.1和1μM的MIA 5 min后,小鼠NC收缩幅度分别降低至(78.82±5.44)%和(46.93±7.36)%(p<0.01);钙瞬变幅度分别降低至(73.41±8.73)%和(49.59±4.01)%(p<0.01);但对胞浆基础钙离子浓度没有明显影响(p>0.05)。灌流0.1和1μM的MIA 15 min后,小鼠NC收缩幅度明显分别增加至(142.91±12.64)%和(204.36±27.22)%(p<0.01);钙瞬变幅度分别增加为(117.51±2.68)%和(132.51±4.30)%(p<0.01);胞浆基础钙离子浓度分别增加为(115.22±1.90)%和(126.93±3.97)%(p<0.01)。当正性肌力作用达到最大后,可使NC很快出现毒性反应,表现为细胞长度缩短,甚至变为球形。但是,对于小鼠CHFC,灌流0.1和1μM的MIA 5 min后,收缩幅度可分别增加至(117.01±1.11)%和(130.08±3.61)%(p<0.01);钙瞬变幅度分别增加为(104.64±2.18)%(p>0.05)和(113.38±2.61)%(p<0.01),但均对CHFC胞浆基础钙离子浓度没有明显影响,分别为(101.13±4.90)%和(104.21±2.49)%(p>0.05)。灌流0.1和1μM的MIA 15 min后,小鼠CHFC收缩幅度(104.55±3.89)%和(101.83±2.62)%、钙瞬变幅度(100.11±4.59)%和(97.27±3.72)%及胞浆基础钙离子浓度(103.63±6.91)%和(99.01±4.82)%均没有显著变化(p>0.05)。⑶在低浓度哇巴因存在下MIA对小鼠NC和CHFC收缩力和细胞内钙的作用。与仅用1μM MIA灌流时相比,小鼠NC用10 nM OUA预先孵育10 min后,再灌流10 nM OUA +1μM MIA,使NC收缩力由原来5 min时降低为(46.93±7.36)%变为降低至(78.49±9.19)%(p<0.01),由原来15 min时增加至(204.36±27.22)%变为增加至(135.42±10.74)%(p<0.01);使NC钙瞬变幅度由原来5 min时降低为(49.59±4.01)%变为(78.51±10.83)%(p<0.01),由原来15 min时增加至(132.51±4.30)%变为增加至(108.64±2.68)%(p<0.01);5 min时对NC胞浆基础钙离子浓度没有明显影响,但15 min时由原来增加(126.93±3.97)%(p<0.01)变为无明显增加(103.11±2.07)%(p>0.05)。然而,小鼠CHFC用10 nM OUA预先孵育10 min后,再灌注10 nM OUA + 1μM MIA,与仅用1μM MIA时相比,OUA+ MIA可以使其收缩力由原来5 min时增加为(130.08±3.61)%变为增加至(183.14±23.77)%(p<0.01),由原来15 min时没有显著性变化(101.83±2.62)%(p>0.05)变为增加至(180.56±18.31)%(p<0.01);使CHFC钙瞬变幅度由原来5 min时增加至(113.38±2.61)%变为增加(155.37±4.89)%(p<0.01),由原来15 min时没有显著性变化(97.27±3.72)%(p>0.05)变为增加至(158.48±8.62)%(p<0.01);使CHFC胞浆基础钙离子浓度由原来5 min时(104.21±2.49)%和15 min时(99.01±4.82)%没有明显影响(p>0.05)分别变为增加为(115.19±1.98)%和(114.37±2.05)%(p<0.01)。⑷小鼠NC和CHFC的NKAα1、α2亚基与NHE-1在蛋白水平的表达。与NC相比,CHFC的NKAα1、α2亚基以及NHE-1在蛋白水平的表达量均显著下降(p<0.01)。结论:哇巴因能够浓度依赖性增加小鼠心肌细胞的基础钙离子浓度、钙瞬变幅度以及收缩力,且对衰竭心脏心肌细胞的作用较对正常心脏心肌细胞的作用显著为强,其原因可能与心衰后小鼠心肌细胞NKAα1和、α2亚基蛋白表达均有所降低有关。NHE-1抑制剂MIA对正常小鼠心肌细胞的收缩力和钙瞬变先减弱后增强,而对心衰小鼠心肌细胞则仅有短暂的正性肌力作用。低浓度哇巴因(10 nM)能够部分抵消MIA对正常小鼠心肌细胞的收缩和钙瞬变作用,但却显著增强了MIA对心衰小鼠心肌细胞的正性肌力作用和钙瞬变作用,提示NHE与NKA在调节心肌细胞收缩过程中存在密切的功能联系,且此调节取决于心肌细胞的机能状况,在正常心肌细胞二者呈协同作用,在心肌细胞发生心衰病理变化后,二者呈拮抗作用。另外,本研究也进一步提示,NHE-1抑制剂可作为强心苷类药物治疗心衰的辅助药具有研究开发前景。