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该研究旨在通过应用Northern Blot及免疫组织化学技术检测p28基因在人肝癌组织中的表达水平与临床病理指标产的关联,确定p28基因在肝癌发生发展过程中的作用.通过基因转染、免疫荧光染色、细胞生物学行为检测和裸鼠荷瘤等实验技术,研究p28蛋白在细胞内的定位及对于细胞生长能力的影响.应用逆转录-巢式PCR技术寻找p28基因在肝癌内的机关报家族成员,并应用RT-PCR方法检测新发现基因在人肝癌组织中的表达水平.通过免疫共沉淀、GST pull-down等技术研究p28和p28-Ⅱ与抑癌蛋白Rb1及细胞周期激酶CDK4间的相互作用,探讨p28和p28-Ⅱ在Rb1-CDK4-Cyclin D1-p16信号转录通路中的作用.Northern blot杂交显示,p28基因在人脑组织中高表达,较弱表达于肺、脾、骨骼肌和心肌,不表达于肝、胰、胃、小肠和大肠等消化道组织.在64例有肝癌组织中,p28基因mRNA的检出率为96.6％(62/64),其中癌较癌旁组织表达明显升高的占91.9％(57/62,2.708±1.418,P<0.001).有门脉癌栓形成的肝癌p28基因的表达显著高于无癌栓的肝癌(P=0.021).肿瘤组织内有静脉侵润的肝癌p28基因的表达明显高于无静脉侵润的肝癌(P=0.047).未发现p28基因的表达升高与乙肝病毒感染、血清AFP水平、肝硬化、肿瘤大小及肝癌分级等其它临床病理指标之间有明显的相关性.应用自行制备的兔抗人p28抗体行肝癌及肝胆管癌组织切片的免疫组化结果显示,p28特异性高表达于恶性肝上皮细胞,不表达于良恶性肿管上皮细胞、血管内皮细胞、Kuffer氏细胞及肝间质细胞.对肝癌组织的免疫组化染色评分与临床病理资料相关联,发现p28在肝癌内的过表达与肿瘤大小呈正相关(P=0.009),与血清HBs抗原感染呈负相关(P=0.001),与Edmonson分级呈负相关.26例人肝癌组织切片同时行p28与Rb1的免疫组化染色结果显示,p28在肝癌细胞核内的表达水平(NIS scores)与Rb1的表达无明显关联,而p28在肝癌组织内的总体表达水平(CICS scores,胞核+胞浆)与Rb1蛋白的表达呈正相关(r+0.475,p+0.019).应用逆转录-巢式PCR技术首次在国人肝癌中发现了p28基因新家族成员p28-Ⅱ(GenBank登录号:AY057056).p28-Ⅱ与p28基因序列相比,较p28基因缺失了近3端的79个碱基,相应蛋白序列在C端缺失了近2个ANK重复序列,同时也缺失了RB蛋白结合域(LxCxE).p28-Ⅱ基因在肝癌内的RT-PCR显示,p28-Ⅱ基因在肝癌内的表达上调,但无p28基因的高表达率明显.综上,该研究在国内首次克隆了肝癌高表达基因p28,在国际上首次发现并报道了p28基因在肝癌内的新家族成员p28-Ⅱ.p28基因高表达于肝细胞肝癌,与肝癌的转移、侵袭密切相关.p28蛋白在肝癌内的表达有肝细胞特异性,与Rb1的表达密切相关.p28-Ⅱ与p28基因都能促进细胞的增殖并能使裸鼠荷瘤.缺失了Rb1结合域的p28-Ⅱ蛋白与p28都能与Rb1相互作用,其分子机理有待于进一步的研究阐明.