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目的:冰片是眼科的常用外用药,具有明目、消翳去障的功效,普遍用于滴眼液中。为了保证制剂的无菌性,眼用制剂中常添加抑菌剂。氮酮在透皮给药时具有很好的促渗透作用,但与抑菌剂合用时会造成抑菌剂对眼表的损伤程度加重,所以不在眼用制剂使用。而同样具有较好促渗透作用的药物--冰片,与抑菌剂合用的作用效应尚未明确。本实验研究冰片与常用抑菌剂苯扎氯铵、苯氧乙醇合用的体外细胞损伤及在体损伤效应,并观察冰片对抑菌剂在结膜囊内的分布、清除过程的影响,初步评价冰片与抑菌剂合用在眼用制剂中的安全性,探讨其部分损伤机制。方法:1.Draize眼刺激实验:正常兔眼分别滴入冰片和各类抑菌剂,于1、2、4、24和72小时后检查角膜、虹膜的改变,根据损伤评分表给分,用所得分数来评价眼刺激性程度。2.溶血试验:家兔耳背中动脉取血,配制成2%的红细胞悬浮液,分成冰片组、抑菌剂组、冰片抑菌剂合用组、溶媒抑菌剂合用组,以生理盐水为阴性对照,蒸馏水为阳性对照,观察三组药物的溶血效应曲线,用等辐射线法和响应面法对其进行分析并重新设计实验,观察冰片与各类眼用抑菌剂的合用类型。3.兔角膜上皮细胞实验:兔角膜上皮细胞生长至对数增长期,分成冰片组、抑菌剂组、冰片抑菌剂合用组、溶媒抑菌剂合用组,以空白组为操作对照,观察药物对兔角膜上皮细胞的损伤及损伤后细胞的恢复生长曲线。4.建立生物样品中苯扎氯铵的液相-质谱联用检测方法和苯氧乙醇的气相-质谱联用的检测方法,对泪液、角膜、巩膜和虹膜中的苯扎氯铵和苯氧乙醇进行定量检测。5.冰片与抑菌剂单次给药在结膜囊内的代谢实验:50μL药物(冰片组、冰片抑菌剂合用组、溶媒抑菌剂合用组)滴眼,于给药后的1、2.5、5、10、15、20、30、45、60和120min收集泪液,测定药物含量,绘制抑菌剂在结膜囊内的代谢曲线。6.冰片与抑菌剂对眼表的损伤:50μL药物(冰片组、冰片与抑菌剂合用组、溶媒与抑菌剂合用组)早晚滴眼给药,分别于第0、14、28天检测泪液分泌量,并进行结膜印记细胞检测,第30天处死动物并摘除眼球,抽取房水,分离角膜、结膜、虹膜、巩膜,检测药物含量,并观察药物对角膜和结膜的损伤。结果:1.Draizc眼刺激实验:1mg/mL冰片与常用浓度抑菌剂的眼刺激评分均小于3.9分,对眼表无刺激性,抑菌剂眼刺激性得分由低到高顺序排列依次为:0.05mg/mL硫柳汞,3mg/mL苯氧乙醇,0.1mg/mL苯扎氯铵,0.3mg/mL羟苯乙酯,5mg/mL三氯叔丁醇。2.溶血试验:在眼用制剂的常用浓度中,羟苯乙酯、苯氧乙醇、三氯叔丁醇与冰片合用的溶血效应为相加,其中羟苯乙酯和苯氧乙醇与冰片合用有轻微的拮抗效应。冰片与硫柳汞合用,高浓度合用效应为协同,低浓度为拮抗。前期实验表明,苯扎氯铵与冰片合用的溶血效应为协同。3.兔角膜上皮细胞实验:眼用制剂常用浓度下苯扎氯铵和三氯叔丁醇对离体兔角膜上皮细胞损伤较大,苯氧乙醇和羟苯乙酯对兔角膜上皮细胞损伤小,且后者与冰片合用,损伤细胞后,继续培养,细胞可以继续生长并恢复正常的细胞形态。4.建立了生物样品中苯扎氯铵的液相色谱-质谱联用检测方法和苯氧乙醇的气相-质谱联用的检测方法,苯扎氯铵在浓度范围0.800μg/L～200μg/L内的线性良好,日内精密度小于5%,方法和提取回收率均在80%以上;苯氧乙醇在浓度范围0.05～50μg/mL内的线性良好,日内精密度小于5%,方法和提取回收率均在85%以上。5.冰片与抑菌剂在结膜囊内的代谢实验:苯扎氯铵十二烷基二甲基苄基氯化铵和十四烷基二甲基苄基氯化铵在结膜囊内清除半衰期t1/2分别为67.26min和88.75 min,平均驻留时间MRT为69.64min与106.39min,冰片可以显著加快两种同系物在结膜囊内的排泄,并显著缩短其在结膜囊内的驻留时间。苯氧乙醇在结膜囊内的清除半衰期t1/2为109.77min,平均驻留时间MRT为76.82min,冰片可以显著加快苯氧乙醇在结膜囊内的排泄,但不影响苯氧乙醇在结膜囊内的驻留时间。6.冰片与抑菌剂对眼表的损伤:0.1mg/mL苯扎氯铵长期给药对眼表损伤大,可导致干眼症,与冰片合用,可增加其在角膜和巩膜的残留,加重对眼表的损伤。3mg/mL苯氧乙醇性质温和,长期给药对眼表损伤较小,与冰片合用不会加重其对眼表的损伤。单独1mg/mL的冰片长期给药对眼表损伤不大。结论:苯扎氯铵长期滴眼,对眼表刺激性大,使杯状细胞减少,可导致干眼,与冰片合用,会增加苯扎氯铵在眼表组织的蓄积,加重对眼表的损伤。苯氧乙醇性质温和,长期滴眼对眼刺激性小,与冰片合用,不会加重苯氧乙醇对眼表的损伤。单独1mg/mL冰片对眼表刺激性小,但要应用到眼用制剂中,仍需考察其与其他成分的相互作用。因此,需要长期使用的滴眼液中不应选用苯扎氯铵为抑菌剂,以免引起干眼症;含冰片的滴眼液中,可优先考虑苯氧乙醇,避免使用苯扎氯铵为抑菌剂或与含有该成分的滴眼液合用。眼用制剂中选择苯扎氯铵为抑菌剂,处方中应添加保护眼睛的成分。