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第一部分:阿帕替尼对非小细胞肺癌氨基酸代谢的影响及机制探讨目的:探索阿帕替尼对非小细胞肺癌氨基酸代谢的影响及相应的调控机制。方法:将阿帕替尼作用于人源性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系A549及H460。使用CCK8、Ed U试剂盒及克隆形成实验检测细胞增殖;Annexin V/PI流式双染检测细胞凋亡;周期试剂盒检测细胞周期分布;Cyto-ID试剂盒、Western blot、GFP-LC3质粒转染及透射电镜检测细胞自噬水平;GC-FID及LC-MS检测细胞内氨基酸含量;2-NBDG摄取实验检测细胞糖摄取水平;Seahorse实验检测细胞糖酵解代谢水平;RNA-seq测序检测相关调控通路,并使用si RNA沉默关键基因ATF4(Activating transcription factor4)后进行验证;通过sh RNA沉默H460细胞中的ATF4表达后构建裸鼠移植瘤模型,根据移植瘤生长曲线检测阿帕替尼与ATF4沉默的体内协同作用。结果:(1)阿帕替尼致NSCLC细胞株增殖被显著抑制,呈剂量及时间依赖:中高浓度阿帕替尼可以诱导细胞凋亡,而低浓度对凋亡无显著作用。阿帕替尼诱导NSCLC细胞株自噬,呈剂量依赖。阿帕替尼对NSCLC细胞株细胞周期无显著影响。(2)RNA-Seq分析表明阿帕替尼显著影响A549细胞代谢相关基因及通路。(3)阿帕替尼对NSCLC细胞株糖摄取和糖酵解水平无显著影响。(4)阿帕替尼显著抑制NSCLC细胞株谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1,催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸)的表达,上调天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS,催化谷氨酰胺与天冬氨酸反应生成谷氨酸及天冬酰胺)和谷氨酰胺转运体SLC1A5(solute carrier family 1 member 5)的表达。(5)阿帕替尼致NSCLC细胞株胞内谷氨酰胺、天冬酰胺浓度随时间逐渐升高;谷氨酸浓度先降低随后升高;天冬氨酸浓度随时间降低。(6)阿帕替尼导致的代谢改变激活氨基酸应答(amino acid response,AAR)通路(GCN2/e IF2a/ATF4),沉默ATF4后,阿帕替尼无法激活ASNS及SLC1A5。(7)沉默ATF4后,阿帕替尼诱导NSCLC细胞株自噬水平升高,凋亡增多。同时细胞内谷氨酰胺浓度升高,谷氨酸浓度降低,天冬酰胺及天冬氨酸浓度无显著改变。(8)体内实验显示低浓度阿帕替尼对H460皮下移植瘤生长无显著抑制作用,而阿帕替尼与沉默ATF4联用具有协同抑瘤作用。结论:(1)阿帕替尼可能通过降低NSCLC细胞内天冬氨酸浓度诱导自噬并抑制增殖。(2)阿帕替尼导致的胞内天冬氨酸浓度下降激活了AAR通路,增加SLC1A5及ASNS的表达,进而促进谷氨酰胺的摄取及代谢,可能是导致其疗效不佳甚至耐药的原因。(3)沉默ATF4增加阿帕替尼对NSCLC的抑制作用。第二部分:阿帕替尼对肺癌免疫微环境的影响及机制探讨目的:探索阿帕替尼对肺癌免疫微环境的影响及相应的调控机制。方法:使用免疫缺陷的裸鼠及免疫正常的C57BL/6小鼠,分别构建人源或鼠源肺癌细胞的小鼠皮下移植瘤模型,给予生理盐水或阿帕替尼灌胃。流式细胞学检测瘤体及外周血中CD8~+T细胞的比例及功能;瘤体中M2型巨噬细胞的比例;瘤体中髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、树突状细胞(dendritic cells,DC)及自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的比例。使用中和抗体清除小鼠体内CD3+T细胞及CD8~+T细胞,或使用Clodronate liposomes清除巨噬细胞后,给予生理盐水或阿帕替尼灌胃,观察移植瘤生长情况。将阿帕替尼作用于M1/M2型极化的巨噬细胞系ANA、RAW264.7或骨髓细胞体外诱导的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM),流式检测细胞分型,RT-PCR检测不同分型细胞因子的表达,流式检测细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测细胞凋亡,NADPH/NADP试剂盒及GSH/GSSG试剂盒检测细胞氧化还原水平,Western blot及透射电镜检测细胞自噬水平及m TOR活性。免疫磁珠分选小鼠脾脏CD8~+T细胞,直接给予阿帕替尼处理或与阿帕替尼处理过的M2型BMDM细胞共培养,流式检测T细胞活性及功能。结果:(1)不论是人源性肺癌细胞H460还是鼠源性肺癌细胞Lewis构建的裸鼠移植瘤模型,阿帕替尼均不能抑制肿瘤生长。(2)阿帕替尼显著抑制C57BL/6小鼠Lewis移植瘤的生长。(3)阿帕替尼未改变C57BL/6小鼠Lewis移植瘤瘤体及外周血中CD8~+T细胞比例、PD-1及CTLA-4的表达,但促进CD8~+T细胞分泌IFN-γ。(4)阿帕替尼不改变C57BL/6小鼠Lewis移植瘤瘤体中MDSC及DC细胞的比例、NK细胞比例及其分泌IFN-γ的水平。(5)体内清除CD3+T或CD8~+T细胞后,阿帕替尼无法抑制移植瘤的生长。(6)体外实验中阿帕替尼升高NSCLC细胞PD-L1表达,而在体内实验中,阿帕替尼未升高裸鼠及C57BL/6小鼠瘤体中PD-L1表达。(7)阿帕替尼致裸鼠及C57BL/6小鼠瘤体中M2型巨噬细胞比例显著下降。(8)阿帕替尼体外逆转M2型巨噬细胞极化:M2型标志CD206、Arg1、IL-10表达降低,M1型标志CD86、Nos2、IL-12表达升高。(9)阿帕替尼体外维持M2型巨噬细胞氧化还原平衡:ROS产生增加,NADPH/NADP及GSH/GSSG比值升高。(10)阿帕替尼体外抑制M2型巨噬细胞增殖,但不导致细胞杀伤:LDH分泌不变。(11)阿帕替尼体外抑制M2型巨噬细胞的m TOR活性,促进细胞自噬。抑制自噬后,阿帕替尼逆转M2极化的功能减弱。(12)CD8~+T细胞在阿帕替尼的直接作用下细胞活性及分泌IFN-γ的功能降低;而CD8~+T细胞与阿帕替尼处理过的M2型BMDM细胞共培养后,细胞活性及分泌IFN-γ的功能升高。(13)体内清除巨噬细胞后,阿帕替尼无法抑制C57BL/6小鼠Lewis移植瘤的生长。结论:(1)阿帕替尼对肺癌的生长抑制作用依赖于CD8~+T细胞及巨噬细胞。(2)阿帕替尼通过逆转巨噬细胞M2极化促进CD8~+T细胞的活化。(3)阿帕替尼抑制M2型巨噬细胞增殖,增加ROS的产生但无显著杀伤作用,这可能与其增加细胞的还原力有关。(4)阿帕替尼可能通过抑制m TOR信号活化诱导细胞自噬,从而逆转巨噬细胞M2型极化。