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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea Virus,PEDV)是目前严重威胁养猪业发展的重要病原之一,主要感染哺乳仔猪,可造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水和死亡。该病最早在1971年发生,并广泛流行,2010年以后,在中国、东南亚和美国等相继大规模爆发由变异PEDV毒株引起的腹泻疫情,并造成了巨大的经济损失。PEDV在宿主体内感染的靶细胞是猪小肠上皮细胞(swine small intestinal epithelium cell,IECs)。为了研究PEDV在体内与宿主细胞内蛋白之间的互作关系,便于揭示其致病机理,本研究以IECs细胞为研究对象,提取了IECs细胞的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,经过选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定,结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×108pfu/mL,随机挑取35个文库菌落对其进行PCR检测,结果显示,插入cDNA片段长度主要位于250-2500bp范围内,文库阳性率达100%,证实该文库具有较好的多态性。PEDV编码的非结构蛋白Nsp12是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),是病毒实现复制、增殖的关键复制酶。为了研究PEDV Nsp12与其宿主细胞IECs内蛋白的互作关系,以本研究构建的IECs-cDNA文库为基础,构建了包含Nsp12基因的诱饵质粒pGBKT7-Nsp12,将诱饵质粒转化到Y2HGold菌株进行自激活和毒性鉴定,并运用酵母双杂交方法从IECs-cDNA文库筛选与Nsp12进行互作的宿主细胞蛋白,同时对其进行回复杂交验证。结果显示:单独表达Nsp12无法同时激活His3/Ade2/AUR1-C/MEL1报告基因的表达,且pGBKT7-Nsp12对酵母菌株无毒性;经过筛选,我们获得了9个呈现蓝斑的菌落,回复杂交结果证实,其中有4个菌落表达的基因分别能够与Nsp12共同激活His3/Ade2/AUR1-C/MEL1报告基因的表达,即:环指蛋白7(RING finger Protein7,RNF7),核糖体蛋白S20(Ribosomal Protein S20,RpS20),半乳糖凝集素1(galectin-1,Lgals1)和二肽基肽酶8(Dipeptidyl pepdiase8,DPP8)。有研究表明RpS20,Lgals1,RNF7和DPP8都能影响病毒的复制,其中,RNF7属于E3泛素连接酶,在真核生物细胞内的泛素蛋白酶体途径中发挥重要作用。为了进一步探讨RNF7与Nsp12是否有互作关系,我们构建了Nsp12和RNF7的真核表达质粒,利用Co-IP和激光共定位等方法鉴定Nsp12与RNF7是否存在互作,结果显示,Nsp12和RNF7存在免疫共沉淀现象,且二者在Vero细胞的细胞质和细胞核内均存在共定位现象。为了探究RNF7是否会影响PEDV的复制,我们在Vero细胞上过表达RNF7蛋白后,在感染PEDV FJzz1/2011株,对感染后不同时间细胞上清进行病毒滴度测定,同时将PEDV FJzz1/2011株感染Vero细胞,对感染后不同时间细胞内RNF7蛋白表达情况进行检测,结果显示,RNF7蛋白过表达后,在早期能够促进PEDV FJzz1/2011株在Vero细胞中的复制;PEDV感染后,与未感染对照细胞相比,细胞内源性的RNF7蛋白表达被上调。本研究构建了PEDV感染的靶细胞IECs-cDNA文库,并利用该文库筛选和鉴定出与PEDV Nsp12蛋白互作的宿主细胞蛋白RNF7,证实RNF7蛋白过表达能够影响PEDV的复制,上述研究结果为今后研究PEDV在宿主细胞内感染和复制的致病机理奠定了基础。