脲酶广泛存在于各种植物、动物、细菌、真菌和人体中,可以催化水解尿素生成二氧化碳和氨,使尿素成为可供有机体使用的氮源,在自然界氮的新陈代谢过程中扮演着关键性的角色。尿素的快速水解,会引起氨的非生产性挥发,造成局部环境pH的升高,给环境和人体带来负面的影响；同时菌类来源的脲酶与人体和动物的一些发病机制密切相关。由于脲酶特殊的生物学功能及在多领域的广泛影响,脲酶的相关研究一直被广泛关注。本文通过分子动力学模拟的方法研究了脲酶体系中镍离子对其结构和功能中的影响；使用计算机辅助药物分子设计的方法,通过同源模建、分子对接并结合生物活性实验进行新型脲酶抑制剂的设计筛选；使用分子对接和分子动力学模拟的方法研究了洋刀豆脲酶与抑制剂小分子的相互作用。1.脲酶的活性中心含有两个金属镍离子,作为辅基对脲酶体系具有重要意义。为探讨镍离子对脲酶结构和功能的影响,通过构建乙酰氧肟酸抑制脲酶的全酶和脱辅基酶体系进行分子动力学模拟。镍离子的存在对体系的动力学模拟是一个挑战,文中采用non-bonded模型,成功再现了脲酶结构中双核多配位的镍离子活性中心,并确认其刚性结构。脱辅基酶体系中,镍离子的离去引起flap区域的构象变化,从活性中心到flap区域的关联被发现；对flap区域关键残基Hisα323的突变模拟表明,从flap区域Hisα323到活性中心还存在另一种关联。通过这两种关联,活性中心可以调控flap区域构象的变化,调节底物进出活性中心的几率,Hisα323是flap区域构象定位的关键性残基。使用MM_GBSA的方法定性地分析乙酰氧肟酸与脲酶的结合自由能,结果表明镍离子存在的静电作用是结合能的主导作用力。2.不同来源的脲酶氨基酸序列具有高度的同源性,文中以巴氏杆菌脲酶晶体结构为模板,使用同源模建的方法构建洋刀豆脲酶的三维结构,该模型与目前得到的洋刀豆脲酶晶体结构非常相似。以模建模型为基础,通过分子对接软件GOLD对数据库进行搜寻,得到具有较好对接得分的若干小分子化合物,并进行抑制活性实验。其中,氨基酸类化合物对接得分较高,但氨基的存在引起活性测试过程中假阳性的干扰,基于药物化学结构修饰的理念,对氨基进行酰化修饰：弱碱性水溶液环境中,乙酸为酰化试剂,常温下磁力搅拌。该反应操作简单,产率较高且后处理简单。3.使用靛酚蓝显色法和酚红指示法建立了洋刀豆脲酶抑制活性的筛选模型。靛酚蓝显色法灵敏度高、重现性好,但实验过程中,部分氨基酸类化合物和酮类化合物呈假阳性现象,需予以排除；酚红指示法不易出现假阳性反应,但被测化合物的初始pH值需在6.8附近,这些限制了两种方法的测定范围。将这两种方法相结合,对分子对接筛选得到的化合物进行活性测试,得到一些具有抑制活性的化合物,其中N-乙酰-L-4-氟苯丙氨酸和2-乙酰基-γ-丁内酯表现出较好的抑制效果,其半数抑制浓度均在微摩尔级别。4.2010年7月,洋刀豆脲酶晶体结构得到解析,以该晶体结构为基础,结合前文筛选得到的活性化合物数据,使用分子对接和分子动力学模拟的方法研究了洋刀豆脲酶和抑制剂小分子的相互作用。模拟结果显示,洋刀豆脲酶活性中心的镍离子可以存在两种配位方式：Ni1和Ni2均为五配位和Ni1为五配位,Ni2为六配位；同时,在对接过程中,镍离子之间桥键的选择非常重要,当抑制剂本身缺少合适的桥原子时,可以引入氢氧根作为桥键参与对接过程。以上研究阐述了镍离子对脲酶体系结构和功能的影响,有助于进一步了解脲酶的催化水解机理；使用计算机辅助药物分子设计的方法设计筛选得到具有抑制活性的化合物,并分析洋刀豆脲酶与抑制剂小分子的相互作用,为基于结构的新型脲酶抑制剂的设计筛选提供有效的指导信息。