一、绵羊MBL的克隆及序列分析为了得到绵羊MBL基因序列,本研究以无角陶塞特羊基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到一特异性片段,经回收重组到pBS-T载体,筛选阳性克隆,测序。结果如下:(1)所测序列长为549bp,含有47bp的外显子1和107bp的外显子2以及395bp的内含子1。外显子1和2共编码51个氨基酸,形成了16个Gly-X-Y三联体重复序列,在第六个三联体重复序列后出现了两个氨基酸的间隔,分别是亮氨酸和精氨酸。(2)不同物种间在MBL基因核苷酸序列上有较高的保守性,所得无角陶塞特羊MBL与牛、人、恒河猴、猪、马、小鼠、大鼠、鸡MBL-C以及牛MBL-A核苷酸序列同源性大小分别为:96.8%、85.7%、85.7%、84.4%、83.1%、81.2%、81.2%、68.83%、80.5%,表明无角陶塞特羊MBL与牛MBL亲缘关系最近,且趋向于MBL-C型。分析无角陶塞特羊MBL与其它哺乳动物MBL编码的氨基酸,发现都含有“GEKGEP”序列,证实这是哺乳动物MBL基因的高度保守区。二、绵羊MBL基因多态性与支原体性肺炎相关性研究MBL作为人类天然免疫系统中重要的一线抗感染分子,已表明与多种疾病相关,如一般免疫缺陷、特异性感染、囊性纤维病(CF)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)等。绵羊支原体性肺炎是由绵羊肺炎支原体所引起的一种特异性感染疾病。本实验中,选取无角陶塞特羊40只、萨福克羊32只、德克塞尔羊29只、湖羊54只静脉采血,ACD抗凝,同时制备血清。用Primer Premier5分析实验一得到的绵羊MBL序列,选取Alu I和BssT1 I内切酶采用PCR-RFLP技术对该基因序列进行多态性分析。同时用间接血凝实验检测四种绵羊肺炎支原体的感染情况。采用DPS统计软件进行数据处理,分析绵羊MBL基因多态性与肺炎支原体感染的相关性。结果如下:(1)无角陶塞特羊、德克塞尔羊、萨福克羊、湖羊在Alu I酶切位点共检测到四种基因型:AA、BB、AB、AC,这四种基因型由A、B、C三种等位基因控制。其中AA基因型是优势基因型,A等位基因是优势等位基因。(2) Alu I酶切位点上:χ2适合性检验无角陶塞特羊、湖羊MBL没有达到Hardy-Weinberg平衡,而德克塞尔羊、萨福克羊已达平衡。多态信息含量(PIC)检测德克塞尔羊和萨福克羊处于低度多态,无角陶赛特羊和湖羊处于中度多态,以湖羊最高。(3)肺炎支原体感染检测结果:湖羊阳性率最高,萨福克羊最低;湖羊的阳性率显著高于无角陶塞特羊和萨福克羊,而与德克塞尔羊差异不显著;德克塞尔羊、无角陶塞特羊、萨福克羊之间差异不显著。(4) Alu I酶切位点:绵羊MBL基因型与其对肺炎支原体的易感性存在相关,AA基因型绵羊感染率显著低于AB和AC基因型,也即AA基因型绵羊对肺炎支原体的抵抗力显著高于AB、AC基因型绵羊。表明AA基因型在适应性方面具有遗传优势,对其深入研究将有助于揭示其作为分子育种标记的可能性。(5) BssT1 I酶切位点:四种绵羊只检测到一种基因型(274bp+250bp+25bp),没有发现多态性。