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类甜蛋白（Thaumatin-like protein，TLP）是一类具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白，在植物抗病防御反应中起着重要的作用。为此，在前期研究基础上，现进一步验证已克隆类甜蛋白基因TaLr35PR5参与Lr35基因介导的成株抗叶锈病防御反应的功能。首先，SignalP4.0预测TaLr35PR5蛋白的前20个氨基酸是典型的信号肽结构，推测TaLr35PR5蛋白可能是胞外蛋白，并通过酵母信号肽分泌系统加以验证;同时，利用洋葱表皮细胞瞬时转化试验对该基因进行了亚细胞定位分析;利用VIGS技术进一步明确该基因在小麦抗叶锈病防御反应中的功能。主要研究内容及结果如下: 1.克隆TaLr35PR5基因信号肽，并构建酵母信号肽诱捕重组载体pSUC2-TaLr35PR5，将其转化至酵母缺陷型菌株YTK12，在双糖培养基上培养，根据酵母对双糖的利用情况来鉴定信号肽的分泌功能。含有pSUC2-TaLr35PR5的酵母克隆可以在蔗糖与棉籽糖培养基上生长，并且能与TTC产生颜色反应，表明TaLr35PR5信号肽具有分泌活性。 2.利用基因枪法将重组载体pCamA-TaLr35PR5-GFP转化洋葱表皮细胞进行融合蛋白的亚细胞定位，以pCamA-GFP为对照。荧光显微镜下观察到对照蛋白在整个细胞中均有表达，而融合蛋白明显分布在胞外区域，推断该蛋白可能是通过信号肽分泌到胞外来执行其防御功能。 3.采用BSMV-VIGS技术对TaLr35PR5基因进行功能分析。接种携带沉默基因的病毒载体和小麦叶锈菌PHNT后，小麦TcLr35的反应型由“1”变为“3”，从抗病变成了感病反应;组织病理学观察显示，基因沉默后吸器和菌丝的数量有明显增多;半定量及实时荧光定量分析表明，基因沉默后TaLr35PR5的表达量明显下降。这些结果表明TaLr35PR5基因在小麦TcLr35成株抗叶锈病的反应中发挥了作用。