论文部分内容阅读
枇杷(Eriobotrya japonica Lind1.)是蔷薇科枇杷属植物,为中国南方的常绿果树。与大多数春天开花的蔷薇科果树如苹果、梨、桃、李等相反,栽培枇杷是“秋花春实”。苹果、梨等蔷薇科果树的重要开花基因如FT、TFL1等已有报道,然而枇杷开花调控的机制尚不清晰。FT和TFL1是成花调控途径中两个关键基因,FT是开花途径的整合基因,FT整合上游开花信号后与b-ZIP转录因子FD结合,调控下游开花基因AP1、LFY的表达,从而诱导花芽分化;TFL1是花序分生组织特征基因,同FT竞争与FD结合,抑制下游AP1、LFY基因表达,以延长营养生长,抑制开花。本研究主要以栽培枇杷品种’解放钟’为实验材料,通过石蜡切片观察顶芽花芽分化时期;克隆得到EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL]-2、EjFD五个基因和 EjTFL1-1、EjTFL1-2 基因的启动子,并进行了序列分析。通过qPCR技术分析了这些基因在不同时期和不同组织的表达模式。同时转化拟南芥验证了EjTFL1-1和EjTFL1-2的遗传功能;并转化烟草表皮细胞,分析了 EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2亚细胞定位;利用BiFC技术验证了 EjTFL1-1、EjTFL1-2分别与EjFD之间的相互作用。研究主要结果如下:(1)观察栽培枇杷’解放钟’和’早钟6号’的顶芽形态变化,并取样制作石蜡切片对其进行解剖学观察,结果显示’解放钟’和’早钟6号’顶芽都在7月开始花芽分化;但二者花序发育进度不同,可能是导致二者开花迟早较大不同,早钟6号更早开花的原因。(2)利用同源基因在枇杷基因组数据库(未公开发表)进行查询,获得了编码EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTEL1-2和EjED的序列,并从’解放钟’中分别克隆得到这五个基因。氨基酸序列比对,表明EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2与其他物种的同源基因的同源性很高,尤其是与同属蔷薇科的苹果同源性最高,均达98%及以上,此外重要氨基酸功能位点都保守。系统进化树分析表明EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2与苹果的MdFT和MdTFL1同源基因亲缘关系最近,聚在同一个小分枝上。EjFD则有保守的b-ZIP结构域。克隆得到EjTFL1-1、EjTFL1-2基因的启动子,并对其顺式作用元件进行了分析,推测EjTFL1-1和EjTFL1-2的表达可能受多种内外环境因素共同调节。(3)以枇杷不同时期顶芽、叶片和其他组织为材料,并用qPCR技术对基因进行时空表达模式分析。结果显示EjTFL1-1和EjTFL1-2主要是在花芽分化前大量表达,并在随后显著下调。而不同组织中的基因表达结果显示EjTFL1-和EjTFL1-2主要是在叶芽大量表达;并且EjTFL1-1在茎中有表达,EjTFL1-2则在花和果实也有表达。EjFT1在叶片、叶芽、花芽和果实中均能检测到表达;而EjFT2则在除叶片外的其他组织中都能检测到表达,而且在花和果实中表达较高。这些结果暗示EjTFL1-1和EjTFL1-2抑制’解放钟’花芽分化,并且提示EjFT1、EjFT2和EjTFL1-2可能还调控’解放钟’花果发育。(4)将EjTFL1-1、EjTFL1-2基因在拟南芥中过表达,明显推迟拟南芥开花时间,此外植株的分枝数量、花序结构、果荚形状等表型与野生型相比也都有明显差异。对转基因植株的TFL1下游基因AP1和LFY进行定量分析,结果显示AP1和LFY的表达明显下调。这些结果说明,EjTFL1-1和EjTFL1-2具有与拟南芥TFL1相似的抑制成花和调控花序发育的功能。(5)EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2转化烟草表皮细胞,发现EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2均分布在细胞核与细胞质中。此外,BiFC实验证明EjTFL1-1、EjTFL1-2分别与EjFD在细胞核内相互作用,与拟南芥的报道相似。