鸡Apela基因的鉴定及表达调控研究

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Apelin是具有多种生物学功能的脂肪因子,其作为天然配体,能作用于oGPCRs APJ受体并激活下游通路进而调节脂肪代谢。近期研究发现,Apela同样可以激活APJ受体,发挥着与Apelin相似的功能,被认为可能是一个新的脂肪因子。本研究通过前期高通量测序数据发现,产蛋高峰期母鸡肝脏中的Apela基因表达量较青年母鸡显著上升,但其是否影响鸡体内脂代谢并不清楚。为研究Apela基因的表达特性以及调控机理,同时揭示其与脂代谢的关系,本试验首先对鸡Apela基因克隆并进行生物信息学分析,然后利用荧光定量PCR技术分析鸡Apela基因的时空表达特性,最后采用雌激素及雌激素受体拮抗剂处理的母鸡和鸡胚原代细胞模型来探究鸡Apela基因表达调控机制。结果如下:  1.荧光定量PCR验证结果表明,鸡Apela基因在产蛋高峰期母鸡肿脏中的表达量较青年母鸡显著升高(P<0.05),与高通量数据结果一致。  2.根据NCBI鸡基因组中的Apela基因预测序列,克隆出鸡Apela基因的编码区序列。鸡Apela氨基酸序列比对分析表明,其与人和鼠的同源性较高,同时与人和鼠Apelin C端的13个氨基酸序列相似度很高;SMRAT软件分析结果显示,鸡Apela拥有LCR蛋白结构域,可能是其与受体结合的活性单元;经过对鸡Apela及Apelin基囚的进化分析后发现,鸡Apela基囚与Apelin基因来源于同一祖先,Apela基因极可能是由Apelin基因分化而来。  3.鸡Apela基因表达特性研究表明,Apela基因在10周龄和30周龄母鸡肝脏、肾脏、胰腺中较高表达,在肺和腺胃中少量表达,而在心脏、脾脏、十二指肠、腹脂、卵巢、胸肌中几乎无表达。Apela基因在后备期(1日龄、1周龄、10周龄、15周龄、20周龄)母鸡肝脏中的表达量较低,而在产蛋高峰期(30周龄和35周龄)母鸡肝脏中表达量显著上调。结果表明鸡Apela基因很可能参与鸡肝脏脂肪合成代谢。  4.用不同浓度的17β-雌二醇对10周龄青年母鸡和鸡胚肝脏原代细胞处理后,母鸡血清脂类指标(TG、TC、VLDL-c)显著升高,同时母鸡及鸡胚肝脏原代细胞中APOB和APOVLDLⅡ基因表达量较对照组显著升高(P<0.05),表明雌激素发挥生理作用,脂代谢旺盛。在雌激素处理体内体外模型中,鸡Apela基因在雌激素处理后的母鸡肝脏中表达量显著升高(P<0.05),同样在雌激素处理后的鸡胚肝脏原代细胞中表达量也显著升高(P<005),表明鸡Apela基因受到雌激素的调控。结果预示鸡Apela参与鸡肝脏脂代谢过程。  5.使用雌激素及其受体拮抗剂MPP(ER-α的高度选择性拮抗剂)、ICI182780和tamoxifen(ERα和ERβ受体的拮抗剂,tamoxifen有兴奋GPR30的作用)处理鸡胚肿脏原代细胞后发现,雌激素处理后Apela基因表达显著上调(P<005),而分别加入MPP、ICI182,780和tamoxifen与雌激素共处理后,Apela基因表达水平较仅雌激素处理组显著下调(P<0.05),而与空白对照组无显著差异(P>005),表明雌激素诱导Apela基因表达主要通过ER-α受体介导调控。  综上所述,鸡Apela基因在母鸡肝脏、肾脏和胰腺中高表达,同时在产蛋高峰期母鸡肝脏中表达上调,雌激素诱导Apela基因表达主要通过ER-α受体的介导调控,Apela基因参与到鸡肝脏脂代谢生物学过程。
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