中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(简称中蜂)是我国特有的蜜蜂品种,与意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica(简称意蜂)相比,它有利用零星蜜源植物、采集力强以及抗螨抗病能力强等诸多优点,这都与它发达的嗅觉系统密切相关,而气味结合蛋白又是嗅觉系统中最重要的蛋白之一,所以探索基于气味结合蛋白的中蜂独特的嗅觉行为的生理机制具有重要意义。本研究在中蜂触角转录组测序分析的基础上,确定了可能存在的气味结合蛋白AcerOBP4、AcerOBP10、Acer OBP12、AcerOBP14、AcerOBP18、AcerOBP21基因,以中蜂采集蜂触角为材料,扩增获得AcerOBP4、10、12、14、21五条基因的ORF序列,并以荧光定量PCR技术获得AcerOBP4、10、12、14、18、21在中蜂触角、头、胸、腹、足、翅六个组织的表达谱;构建pET-30a原核载体,体外成功诱导AcerOBP10、12、14、21四个蛋白表达,然后利用荧光竞争实验研究AcerOBPs的配基结合谱;通过光谱法研究AcerOBP12与吡虫啉结合机理后,再利用SWISS-MODEL蛋白结构预测、分子对接和点突变技术确定二者结合时关键氨基酸位点;最后通过免疫抗体制备、脑解剖、免疫电镜等,以期对AcerOBP12在中蜂触角中进行亚细胞定位以及AcerOBP12和乙酰胆碱受体在脑中的共定位。本研究获得的主要结果如下:1.首次获得中蜂AcerOBP4(GenBank登录号:KP717059.1)、Acer OBP10(KP717060.1)、AcerOBP12(KP717061.1)、AcerOBP14(KP717062.1)、AcerOBP21(KP717063.1)五条基因的ORF序列,全长依次为414 bp、450 bp、453 bp、408 bp、408 bp,编码137、149、150、135、135个氨基酸,序列分析:AcerOBP4、10含有6个保守的半胱氨酸,而AcerO BP12的5个Cys中有4个在保守位点(其中一个Cys在非保守位点),AcerOBP14、21都只有4个保守的Cys,SignalP 4.0预测显示它们N端都有明显的信号肽。在线软件PSIPRED和SWISS-MODEL分析AcerOBP4、10、12、14、21蛋白高级结构表明:除AcerOBP4只有4个α螺旋二级结构外,其他几个OBPs都包括6个α螺旋结构,Molegro Virtual Docker预测它们都有多个配基结合腔。进化树分析显示它们与蜂属的气味结合蛋白都具有较高的相似度,其中AcerOBP10与多种性信息素结合蛋白相似度较高,可能是pbp-obpsupper-family成员。2.以real-timefluorescentquantitativepcr获得acerobp4、acerobp10、acerobp12、acerobp14、acerobp18、acerobp21六个基因在中华蜜蜂18日龄后工蜂六个组织的表达谱(包括:触角、头、胸、腹、足、翅)。整体水平上,6个基因中acerobp4表达丰度最高,acerobp10表达丰度最低,其中触角中的表达量又高于其他组织。在触角中acerobp4、14、21表达量较高,其中acerobp4表达丰度是acerobp10的20000倍以上;在脑和胸中acerobp4和acerobp21的表达丰度高;而腹和足中,所有acerobps表达量都较其他组织低;翅中acerobp4和acerobp14表达量要高于其他四个acerobps基因。3.成功构建了pet-30a-acerobp4、10、12、14、21五条基因的原核表达载体,并诱导获得acerobp10、12、14、21四个蛋白,且均主要为包涵体表达,采用ni2+-琼脂糖凝胶柱纯化并透析获得具有生物活性的重组蛋白。荧光实验中,n-苯基-1-萘胺滴定重组蛋白结果表明所测试的acerobps都与其较好结合,确定1-npn为荧光竞争结合实验的探针。荧光竞争实验结果显示acerobps配基结合谱及结合力各不相同,它们都能和多种信息素和外源植物挥发物结合,其中蜂王信息素成分之一的对羟基苯甲酸甲酯hob和开花植物普遍存在的挥发性气味分子β-紫罗兰酮是它们普遍高亲和力结合的两种物质,推测这两种物质可能对中蜂生命活动比较重要。此外,acerobp10和测试的多种信息素结合力强,进一步确认其为pbp。4.多重光谱学研究acerobps与吡虫啉结合,蛋白荧光发射光谱发生规律性的猝灭,二者结合力强。变温实验结果显示随着温度升高,动态公式斜率ksv逐渐减小,说明acerobp12与吡虫啉作用的整个过程为静态猝灭(staticquenching),即温度升高二者结合力变弱。热力学参数分析发现:在低温时(20到25℃),Δh>0、Δs>0,表明维持它们的力为疏水作用;在较低温度(25到30℃)时,二者的Δh<0、Δs>0,表明维持它们的力为疏水作用和静电作用;在较高温度(30到35℃)时,它们的Δh<0、Δs≤0,说明维持二者稳定的主要作用力为氢键和范德华力。因此,在这个结合过程中随着温度变化是不同的作用力维持二者的结合稳态。同步荧光显示色氨酸(trp)的荧光强度猝灭剧烈,且最大发射波长发生蓝移,而酪氨酸(tyr)基本不变化,说明二者结合腔更靠近色氨酸。圆二色谱cd结果显示,随着吡虫啉浓度的增加,α螺旋减少,吡虫啉导致acerobp12构象发生改变。5.通过蛋白结构预测和分子对接,我们从是否形成氢键及氢键强弱和氨基酸供能大小两个方面确定了AcerOBP12与吡虫啉作用时7个可能的关键氨基酸位点,分别为Lys117、Tyr78、Arg77、Tyr46、Asp28、Phe88、Leu121,然后利用点突变和蛋白诱导纯化成功获得突变型AcerOBP12蛋白。利用荧光光谱法研究突变型与吡虫啉的作用,结果表明突变体中AcerOBP12-F88G与吡虫啉结合明显减弱,结合常数由野生型的5.4×104 L/mol下降为3.5×104 L/mol,AcerOBP12-Y46G与吡虫啉结合稍微变弱,结合常数为4.8×104 L/mol,其他位点不会明显减弱二者结合,甚至AcerOBP12-K117G和AcerOBP12-Y78G与吡虫啉结合明显增强,推测氨基酸Phe88是二者结合时的关键位点。结合第五章荧光变温实验结果,我们推断氢键在二者结合中并不起到主要作用,而Phe88提供的作用力对二者结合稳态具有重要作用。6.通过蛋白免疫定位研究AcerOBP12在中蜂触角中分布以及AcerOBP12和乙酰胆碱受体在脑中的共定位。诱导获得中蜂AcerOBP12蛋白作为抗原,在线多肽设计获得乙酰胆碱受体多肽抗原,然后分别免疫新西兰大白兔和小鼠,获得AcerOBP12兔多抗和乙酰胆碱受体多肽AccnAchRb2小鼠多抗。ELISA检测表明:AcerOBP12兔多抗和乙酰胆碱多肽AccnAchRb2鼠多抗效价很好,可以进行免疫定位实验。脑解剖实验中我们能在短时间内快速、干净的获得中蜂全脑,为后续试验提供可能。