肥胖是现代社会中常见的营养障碍性疾病,其发病率在发达国家和发展中国家逐年上升,成为一个全球性的健康问题。肥胖不仅是导致心脑血管疾病、糖尿病、高血压、高脂血症等疾病的高危因素,并且还带来多个社会问题和心理问题。多年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关;近年来继神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)、刺鼠相关蛋白(agouti related protein,AgRP)、增食欲素(orexin,ORX)之后,又一个与食欲相关的神经肽-黑色素浓集激素(melanin-concentrating hormone, MCH)进入人们的视野,随着研究的逐步深入相继发现了MCH的2个受体亚型—MCHR1(melanin-concentrating hormone receptor 1, MCHR1)和MCHR2(melanin-concentrating hormone receptor 2, MCHR2)。多个动物实验证实MCH是一种能够增加食欲的神经肽,在调节能量平衡中起重要作用。建立过度表达MCH的转基因小鼠,发现小鼠摄食过多,具有高脂蛋白血症、高血糖、胰岛素抵抗特点。敲除小鼠MCH基因,可导致消瘦综合征(表现为小鼠摄食减少,代谢增加,体重减轻),由此可见MCH在调节体重中起关键性作用。用基因敲除技术研究MCHR1的功能,发现MCHR1敲除小鼠体形瘦,脂肪含量低,进食高脂饮食不易诱发肥胖;而MCHR1失活可减轻高脂饮食所诱导的肥胖。现人们已研制出MCHR1的拮抗剂以期望治疗肥胖症。可见目前对MCH及MCHR1与肥胖和能量代谢的关系已明确,但MCHR2功能目前仍不清楚,国内外未见其与肥胖关系的明确报道。MCHR2基因定位于染色体6q16.2-6q21, cDNA全长1023 bp,编码340个氨基酸的蛋白质。通过定量RT-PCR、Northern杂交及原位杂交技术证实MCHR2主要在大脑表达,尤其在下丘脑前部和外侧区以及腹内侧核区表达丰度高,而摄食调控中枢位于下丘脑,表明MCHR2可能参与进食行为的调控。此外,据报道肥胖患者在第6号染色体长臂发生细胞遗传学改变,而MCHR2正好定位于染色体6q,也提示MCHR2可能与肥胖的发生相关。因此需要对MCHR2基因的功能做进一步研究以明确其与肥胖的关系,从而为肥胖症的防治提供新的靶点。RNA干扰(RNA interference , RNAi)是通过双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程。它作为新兴的基因阻断技术,逐渐成为探索基因功能的新手段。本课题采用RNA干扰技术,以人MCHR2基因为靶点,设计并合成shRNA真核表达载体,并研究其对细胞中MCHR2的表达及生物活性等特征的影响,为进一步利用RNAi在动物整体水平研究MCHR2基因功能奠定良好的实验基础。本研究主要分以下三个部分:1.稳定表达人MCHR2基因CHO细胞系的建立。方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blotting及免疫荧光法检测MCHR2的表达;利用放射性配体结合实验(Radioligand binding assay,RBA)、钙流检测、环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)测定等鉴定MCHR2特征。结果:成功构建pcDNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体,并建立稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因;RBA检测其最大结合容量(Bmax)为309.97±1.14 fmolL-1·mg-1protein,平衡解离常数(Kd值)为0.170±0.0006 nmol/L;黑色素浓集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)能刺激Ca2+释放,其半数有效浓度(50% effective concentration,EC50)为2.32±0.01 nmol/L。结论:稳定转染MCHR2的CHO细胞系建立及其特征鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的实验基础。2.人MCHR2基因shRNA的设计及真核表达载体的构建与鉴定。方法:根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片断,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒。结论:针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建为进一步利用RNAi研究MCHR2功能奠定了良好的基础。3.shRNA真核表达载体对人MCHR2基因表达及特征的影响。方法:将shRNA真核表达载体转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中,通过RT-PCR测定细胞中MCHR2基因mRNA水平的表达;Western blotting检测MCHR2蛋白水平的变化;放射性配体结合实验(RBA)检测受体最大结合容量(Bmax)及平衡解离常数(Kd值)的变化;钙流检测实验观察配体(MCH)刺激后单个细胞Ca2+释放及MCH半数有效浓度(EC50)的变化。结果:shRNA真核表达载体能有效抑制CHO细胞中MCHR2基因的表达。与转染pGenesil-1空载体组比较,使MCHR2基因mRNA表达减少45.8%～66.4%;蛋白表达减少44.2%～81.0%。RBA实验中pGenesil-1-MCHR2-shRNA使Bmax减少,Kd值升高;与转染pGenesil-1空载体组比较,Bmax减少39.4%～78.7%,Kd值升高40.9%～81.9%。shRNA真核表达载体转染后MCH刺激单个细胞Ca2+释放的Ratio A减小,EC50升高;与转染pGenesil-1空载体组比较,EC50升高114.8%～822.4%。结论:MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效抑制MCHR2基因的表达,减少Bmax、升高Kd值及EC50从而对MCHR2生物特征产生影响,为利用RNA干扰技术研究人MCHR2基因功能奠定良好的实验基础。