论文部分内容阅读
禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由反转录病毒科禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒（ALV/RSV）引起的，以造血细胞恶性增生为主要病变的一类禽的多种良性和恶性肿瘤性传染病。根据病毒的囊膜蛋白、与病毒宿主特异性相关的gp85蛋白抗原性的差异以及交叉中和试验等，将禽白血病可分为A～J10个亚群，其中只有A、B、C、D、E和J亚群能感染鸡。目前，商品鸡群中以致病性外源性病毒以A亚群和J亚群感染为主，二者流行性最为广泛，且ALV-J较其它亚群的外源性ALVs有更强的水平传播能力。病毒分离鉴定表明，白血病/血管瘤主要是由J亚群禽白血病病毒引起，但也同时有的是由A、B亚群白血病病毒感染引起的。这不仅仅是肉鸡和蛋鸡的问题，这也是我国地方品系鸡（如麻鸡、三黄鸡等）的主要问题。由于经典的A、B、C、D亚群白血病在我国长期得不到关注且无任何净化措施，极有可能已经在地方品系鸡中广泛流行，甚至发生了新的变异产生了新的亚型。1. SDAU12株ALV-J病毒的分离鉴定本实验通过接种DF-1细胞，成功的从广州某三黄鸡种鸡场分离到一株外源性ALVSDAU12，测得了其env基因序列，并与其他亚群的已知参考毒株进行了同源性比较。分析结果表明，SDAU12毒株的gp85基因与AD亚群外源性参考毒株的同源性在49.5%51.4%；与内源性E亚群参考毒株的同源性仅51.1%左右，而与4株J亚群国际参考株之间的同源性较高，为87.4%94.6%，其中与SD07LK1的同源性最高，可达94.6%；gp37基因与SD07LK1的同源性最高为95.2%。SDAU12毒株gp85基因编码的氨基酸序列与其他参考毒株的同源性与4株J亚群参考株之间的同源性较高，为84.3%92.5%之间，其中与SD07LK1株的同源性为92.5%。其gp37基因编码的氨基酸序列的同源性与内源性E亚群参考毒株的同源性仅为58.2%，而与4株J亚群参考株之间的同源性较高，为91.3%94.4%之间，其中与SD07LK1株gp37基因编码的氨基酸序列的同源性最高，为92.5%。2.利用ELISA、FA及IFA法对该病毒在DF1细胞上增殖动态的比较分析为了比较酶联免疫吸附试验、直接免疫荧光和间接免疫荧光技术三种试验方法在J亚群禽白血病病毒增殖过程中动态监测的敏感性，并以此为基础分析评估者三种试验方法在生产实践中的实用性，首先将该毒株其接种于DF-1细胞（C/E系）上，运用间接免疫荧光法测得其半数致死量TCID50为10-4.02，然后分别按照1×104，1×103，1×102TCID50四个浓度接种于处在对数期的DF1细胞上，并设置空白对照组，每个梯度设三个重复。分别在接种后维持1d、2d、3d、4d、5d、6d时收取细胞上清液，并立刻保存至-80℃，用于酶联免疫吸附试验法针对禽白血病病毒P27抗原的特异性检测；此外，飞片法收集每个梯度1d～6d的DF1细胞，用于直接免疫荧光法和间接免疫荧光法针对J亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体JE9的检测。实验结果表明，酶联免疫吸附试验法在接种维持后的第三天可检测出1×104和1×103TCID50浓度的上清液中含有少量的阳性细胞，而直至第四天才能检测出1×102TCID50浓度上清液有阳性细胞；直接免疫荧光法第三天便能检测到接种1×102TCID50浓度的细胞中含有阳性细胞，另外两个浓度在第一天即可观察到阳性细胞，但阳性细胞量较少；间接免疫荧光法在接种1×102TCID50浓度病毒后维持的第二天便有阳性细胞的检出，而1×104和1×103TCID50浓度第一天即可检测到大量的阳性细胞。结论：1.通过对SDAU12毒株基因序列的分析，根据该病毒与其他参考毒株之间的gp85及gp37基因的核酸序列及他们所编码的氨基酸序列同源性的比较分析，可以确定本实验所分离的SDAU12毒株确实是ALV-J，该毒株与参考毒株SD07LK1的同源性最高，这两株ALV-J的关系比较密切。该病毒是从广州某三黄鸡种鸡场疑似ALV感染病鸡中分离得到的，由此可知，ALV-J已经蔓延至我国多种地方品系鸡。2.接种病毒后，间接免疫荧光法对SDAU12病毒感染的阳性细胞的检出率最高而且检出病毒的时间最早，直接免疫荧光法次之，而酶联免疫吸附试验的敏感性最低。酶联免疫吸附试验的可操作性强，步骤简单明了，但其敏感性较低，且假阳性率和假阴性率较高；而间接免疫荧光法准确性和敏感性都很高，但需要配备荧光显微镜，技术要求较高，因此，在家禽养殖的生产实践中，为了更好地进行J亚群禽白血病病毒感染的监测，我们应选择在对样本进行酶联免疫吸附试验检测的同时，结合间接免疫荧光法以确保实验结果的准确性和可信度。