【摘 要】
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异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是三羧酸循环中的关键酶之一，以NAD+或NADP+为辅酶催化异柠檬酸氧化脱羧，生成-酮戊二酸，CO2和NAD（P）H，为生物体内的新陈代谢提供能量及为氨基酸合成提供前体物质。根据辅酶特异性，自然界中的IDH可以分为两类，NAD-依赖性IDH （EC1.1.1.41, NAD-IDH）和NADP-依赖性IDH （EC1.1.
【基金项目】
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国家自然科学;教育部科学技术研究;；
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异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是三羧酸循环中的关键酶之一，以NAD+或NADP+为辅酶催化异柠檬酸氧化脱羧，生成-酮戊二酸，CO2和NAD（P）H，为生物体内的新陈代谢提供能量及为氨基酸合成提供前体物质。根据辅酶特异性，自然界中的IDH可以分为两类，NAD-依赖性IDH （EC1.1.1.41, NAD-IDH）和NADP-依赖性IDH （EC1.1.1.42, NADP-IDH）。NADP-IDH可以分为同源二聚体型和单体型两种形式。真核生物和大部分原核生物含有同源二聚体NADP-IDH，少数细菌含有单体NADP-IDH。NAD-IDH有同源二聚体和异源多聚体两种存在形式。真核生物的NAD-IDH为异源多聚体，一些细菌和古菌的NAD-IDH则为同源二聚体。本实验克隆了野油菜黄单胞菌8004（Xanthomonas campestris. campestris8004）的IDH基因（XcIDH）并在大肠杆菌中进行了表达。SDS-PAGE检测表明，XcIDH亚基分子量约为35kDa，凝胶过滤层析显示XcIDH的分子量约为61.9kDa，表明XcIDH在溶液中是一种同源二聚体结构。XcIDH的活性完全依赖于Mg2+或Mn2+，但受到Zn2+和Ca2+的强烈抑制。XcIDH在Mg2+或Mn2+存在条件下的最适pH分别为pH7.5和pH8.5，最适温度分别为40°C和45°C。热失活研究发现XcIDH在45°C的条件下孵育20min，还残留50%的活性。酶动力学研究表明，在Mn2+存在条件下，XcIDH对NAD+的Km值为133μM，对NADP+的Km值为3260μM。 XcIDH对辅酶NAD+的偏好性([kcat/KDm]NA/[kcat/Km]NADP是其对辅酶NADP+偏好性的70倍。为了进一步研究IDH辅酶特异性的分子机制，本研究对XcIDH的辅酶特异性进行了转换。氨基酸序列比对发现，Asp268、Ile269以及Ala275是XcIDH结合辅酶NAD+的关键位点。利用定点突变技术分别将这三个位点替换成Lys268、Tyr269以及Val275。突变体酶对NADP+的偏好性([kcat/Km]NADP/[kcat/KDm]NA)是NAD+的17倍，证明突变体酶的辅酶特异性成功的由NAD+转换成NADP+。对IDH的研究主要集中于NADP-IDH的酶学性质及晶体结构，关于NAD-IDH酶学性质及进化关系研究较少。本研究首次以实验证明了XcIDH为二价金属离子依赖性的二聚体NAD-IDH且具有较好的热稳定性，为研究野油菜黄单胞菌次级代谢产物的代谢调控研究提供有用的信息。
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