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目的: 抗增殖蛋白(PHB)是维持脂肪细胞分化和线粒体正常功能的关键蛋白,但是PHB在脂肪形成过程中的调节机制尚不明确。microRNA(miRNA,miR)是一类通过结合mRNA,对基因转录后水平调控的小分子编码RNA,参与多种生理病理过程。本研究通过转染慢病毒过表达miR-27、PHB,经典激素鸡尾酒法诱导脂肪干细胞(ASC)定向分化,检测分化过程中miR-27、PHB、相关脂肪形成标志物的表达以及线粒体结构功能上的变化。目的在于探讨miR-27对脂肪形成的影响,确定miR-27靶基因,以阐明miR-27对脂肪细胞分化的作用机制,为临床治疗肥胖提供一些理论基础。 方法: 1、诱导剂(胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛)直接定向诱导ASC细胞分化为脂肪细胞,在分化第0、1/2、1、2、4、7、14天提取RNA分析miR-27a、miR-27b、PHB及脂肪形成标志物(PPARγ、aP2)的变化。 2、培养ASC细胞,当细胞密度为30％时,以转染慢病毒Lenti/miR-Control作为阴性对照组,实验组过表达miR-27a和miR-27b三天后,诱导ASC细胞分化为脂肪细胞,在分化第0、1、4、14天提取细胞蛋白质、RNA分析PHB、脂肪形成标志物(PPARγ、aP2)的变化,以及在第0、14天检测线粒体结构和功能的变化。 3、构建表达荧光素酶报告基因PHB及其突变型(删除6个与miR-27结合的碱基)的质粒。以转染慢病毒 Lenti/miR-Control作为阴性对照组,实验组过表达miR-27a和miR-27b。一天后分别转染Lenti/UTR-Luc/Blank(空白对照)、Lenti/UTR-Luc/PHB、Lenti/UTR-Luc/PHB-mut,两天后检测各实验组 ASC细胞荧光素酶活性。 4、以转染慢病毒Lenti/miR-Control作为阴性对照组,实验组过表达miR-27a和miR-27b。一天后转染Lenti/GFP(空白对照)、Lenti/PHB,两天后促ASC分化,观察PH B可否修复受抑的脂肪细胞分化。 结果: 1、诱导剂诱导ASC细胞分化后,与对照组(第0天)相比,分化第2天开始PHB及脂肪形成标志物PPARγ、aP2的mRNA水平明显上升,同时miR-27a及miR-27b随分化进行持续降低。 2、过表达miR-27a或miR-27b后,与对照组(miR-Control)相比,分化过程中PHB、PPARγ、aP2的蛋白表达降低。 3、慢病毒转染Lenti/UTR-Luc/PHB、Lenti/UTR-Luc/PHB-mut于已预先过表达 miR-27的 ASC细胞,与对照组( Lenti/UTR-Luc/Blank)相比,实验组Lenti/UTR-Luc/PHB的 ASC细胞荧光素酶活性明显降低而 Lenti/UTR-Luc/PHB-mut未受影响。过表达PHB则可修复由miR-27引起的脂肪形成减少。 4、与对照组(miR-Control)相比,分化14天后,接近20%过表达miR-27a或miR-27b的ASC细胞线粒体结构破坏以及功能受损。 结论: 1、诱导剂(胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛)可直接定向诱导ASC分化为脂肪细胞。 2、miR-27a和miR-27b可抑制ASC脂肪细胞分化。 3、PHB是miR-27抑制脂肪分化的作用靶点,过表达PHB可修复由miR-27引起的脂肪细胞分化抑制。 4、脂肪形成过程中miR-27可引起线粒体结构变化及功能障碍。