背景前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系统较常见的恶性肿瘤,在欧美国家,PCa发病率高居男性恶性肿瘤之首。由于我国人口老龄化以及诊断技术不断提高,PCa的发病率以每年10%的速度攀升,严重威胁着中老年男性的健康。然而,PCa的发病机制十分复杂,PCa发生以及进展过程中诸多影响因素尚未阐明,制约着PCa的有效诊治。近年来,前列腺癌抗原3(differential display code 3 for prostate cancer, DD3)与前列腺癌的关系越来越受到人们的重视。(1)长链非编码RNA与PCa长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是长度超过200个核苷酸、并具有调控基因的表达作用的非编码RNA。越来越多的研究表明,lncRNA参与细胞凋亡、肿瘤浸润和转移等过程,在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌或抑癌的作用；lncRNA还可以通过表观遗传调控的方式影响肿瘤细胞的生长,从而有希望成为新型肿瘤标志物并成为肿瘤治疗的靶点,同时lncRNA在肿瘤诊断和肿瘤治疗方面显示出广阔的临床应用前景。DD3是目前发现的一种PCa组织中高表达的一种lncRNA,与PCa关系密切,在对PCa的诊断效能上其敏感性和特异性均优于传统的PSA,有良好的临床应用前景。(2)DD3与PCaDD3基因是在1999年由Bussemakers等发现的一种前列腺癌特异性基因,位于人类染色体9q21～22。DD3基因不表达蛋白,但它与前列腺癌的发生密切相关,它特异性的高表达于人类约95%的前列腺癌细胞,而在正常前列腺和良性前列腺增生细胞中仅仅少量表达或无表达。有研究发现,DD3的基因表达用于鉴别前列腺癌和前列腺良性病变的准确性可达100%。前列腺以外的恶性及良性病变则没有DD3的表达。这说明DD3基因是目前为止鉴别前列腺恶性肿瘤的最特异肿瘤标记物。与PSA不同,DD3基因不受患者年龄、前列腺体积及其它如前列腺炎等前列腺疾病的影响。同时有研究发现,DD3基因表达与前列腺癌的肿瘤体积、病理分期以及病理的Gleason评分呈明显相关,且在患者的肿瘤体积>0.5mL和Gleason评分≥7的病例中,DD3基因表达呈明显升高。在一项前列腺癌预后的多因素研究分析中,DD3基因被认为可以成为前列腺癌预后分析的独立预测因子。有研究表明,结合患者PSA以及Gleason评分,DD3预测前列腺癌是否存在肿瘤包膜外侵犯的准确率可达90%。而对于Gleason评分较低、低PSA值和低DD3基因表达的前列腺癌患者,临床上可以仅给予密切的监测随访,等待观察。PCa患者尿液中的细胞和细胞碎片能检测出DD3的高表达,刘光香等人运用RT-PCR技术研究发现,在临床54例PCa患者中,其外周血DD3 mRNA表达阳性者48例,另有23例前列腺增生患者和9例健康成年男性外周血未见DD3mRNA的阳性表达[15]。这可能是前列腺癌患者血液中的淋巴细胞吞噬了前列腺癌细胞,从而血液中可检测到DD3 mRNA的表达。DD3基因是长链非编码RNA,而目前多种证据表明lncRNA在多种肿瘤的生长及侵袭转移中发挥了非常重要的作用。DD3作为一种不表达蛋白的lncRNA,在前列腺癌的发生发展中的具体作用以及DD3对前列腺癌增殖、凋亡、转移和侵袭能力的影响目前仍不明确,有待进一步研究。目的通过细胞学、分子生物学及动物模型构建等技术从体内和体外两方面系统的探讨DD3基因对于前列腺癌生长、凋亡、转移和侵袭能力的影响,为我们进一步研究DD3基因在前列腺癌发生、发展中的作用及其机制打下良好的基础,为前列腺癌的临床诊疗提供新的线索和方向。方法我们采用在体外培养前列腺癌研究中较常用的LNCaP细胞株和PC3细胞株。然后采用实时定量PCR技术测定LNCaP细胞株与PC3细胞株的DD3基因表达水平,并通过小RNA干扰技术(siRNA)和基因过表达技术构建DD3敲减质粒和DD3过表达质粒及其对应的对照质粒,慢病毒包装质粒后,通过细胞转染建立DD3低表达的LNCaPDD3-细胞株和DD3高表达的PC3DD+细胞株及两者的对照组细胞株LNCaPNC和PC3Ctrl。然后采用细胞计数法和MTT方法检测所构建的前列腺癌细胞株LNCaPDD3-、LNCaPNC、PC3DD+和PC3Ctrl的细胞增殖能力,从而确定DD3对前列腺癌细胞的增殖能力的影响；用ABL-N诱导前列腺癌细胞株LNCaPDD3+、LNCaPNC、PC3DD+和PC3Ctrl凋亡后,运用Annexin V+PI双染法检测各组细胞株的早、中晚期的凋亡情况,并确定DD3基因在前列腺癌细胞凋亡中的作用；运用划痕实验和Transwell小室进一步检测上述各前列腺癌细胞株的迁移以及侵袭能力,确定DD3基因在前列腺癌细胞迁移、侵袭中的作用。在体内实验中,我采用裸鼠体内成瘤实验检测上述各组细胞株在体内形成的种植瘤的体积、重量,然后将前列腺癌瘤体石蜡包埋、切片,并利用免疫组化染色法检测瘤体组织细胞中Ki67蛋白的表达水平；并利用TUNEL法检测前列腺癌肿瘤组织细胞的凋亡水平；进一步研究DD3在体内对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响。结果1.q-PCR检测结果表明,用RNAi技术特异性的沉默LNCaP细胞内的DD3的表达后,与对照组LNCaPNC细胞相比,干扰后LNCaPDD3-细胞内DD3的表达显著降低(P<0.01)；而过表达DD3后的PC3DD3+细胞内的DD3的表达水平显著高于对照组PC3Ctrl细胞(P<0.01)。证明LNCaPDD3-和PC3DD+细胞株建立成功。2.细胞计数法和MTT方法检测LNCaPDD3-和PC3DD+细胞相对于其对照细胞LNCaPNC和PC3Ctrl的增殖能力,结果表明,DD3低表达的LNCaPDD3-细胞的增殖速度明显低于其对照组LNCaPNC细胞(P<0.05)；而DD3高表达PC3DD3+细胞的增殖速度明显高于其对照组pC3Ctrl细胞(P<0.05)。3. Annexin V+PI双染法检测前列腺癌各细胞株凋亡情况的结果显示：DD3低表达的LNCaPDD3-细胞株的抗凋亡能力显著低于对照组LNCaPNC细胞(P<0.01)；而DD3高表达的PC3DD3+细胞的抗凋亡能力明显高于对照组PC3Ctrl细胞(P<0.01)。4.划痕实验和Transwell小室检测DD3基因对前列腺癌细胞的迁移、侵袭能力的结果发现：DD3低表达的LNCaPDD3-细胞的迁移和侵袭能力明显低于对照组LNCaPNc细胞(P<0.05)；而DD3高表达的PC3DD3+细胞的迁移和侵袭能力明显高于对照组PC3Ctrl细胞(P<0.05)。5.测量裸鼠成瘤实验所获得的LNCaPDD3-与LNCaPNC,PC3DD+与pC3Ctrl种植瘤的体积和重量发现DD3低表达的LNCaPDD3-组种植瘤体积和瘤重均小于对照组LNCaPNC(P<0.01);而DD3基因高表达的PC3DD3+组种植肿瘤的体积和瘤体重量均大于对照组PC3Ctrl(P<0.01)。对瘤体组织采用TUNEL法检测组织细胞凋亡水平和免疫组化染色方法检查细胞增殖标志物Ki67蛋白表达水平的结果发现DD3低表达的LNCaPDD3-组种植肿瘤中组织细胞的凋亡水平明显高于对照组LNCaPNC(P<0.05);而肿瘤组织细胞的增殖能力也明显小于对照组LNCaPNC(P<0.05)；DD3高表达的PC3DD3+组肿瘤组织细胞的凋亡水平明显低于对照组PC3Ctrl(P<0.05);而肿瘤组织细胞的增殖能力明显大于对照组PC3Ctrl(P<0.05)。结论(1)DD3基因参与了前列腺癌细胞体外生长的调控,可促进前列腺癌细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力,能提高前列腺癌细胞体外抗凋亡能力。(2)DD3参与调控前列腺癌细胞的体内成瘤能力,可以促进前列腺癌细胞在体内的增殖能力和提高癌细胞在体内的抗凋亡能力。(3)进一步深入研究DD3在前列腺癌细胞中的作用机制可为前列腺癌的早期诊断和研制新的靶向治疗药物提供重要帮助。