研究背景:尿路上皮是一种多层上皮,是血液与尿液之间的一个重要屏障。成熟的尿路上皮由不同类型的细胞排列构成,根据其所处位置以及形态被划分为基底细胞、中间细胞以及浅表细胞。在正常情况下,成体啮齿类动物的尿路上皮几乎处于静止状态,大约每200天经历一次细胞更替。然而,对于因暴露于化学物质（如环磷酰胺和硫酸鱼精蛋白）、尿路致病菌或手术损伤而引起的急性膀胱损伤,尿路上皮可以启动快速的修复和再生过程。我们以及其他研究小组前期通过细胞谱系示踪实验探究了尿路上皮再生的细胞起源和细胞分裂模式。然而我们目前对膀胱再生过程中细胞的异质性、状态改变以及它们的相互调控仍然缺乏全面的理解。单细胞转录组测序技术的应用使我们能够在单细胞分辨率研究细胞的转录动力学,并探索各种生物学过程,比如细胞周期调节及细胞间相互通讯。这将极大的帮助我们全面了解膀胱的再生过程。研究目的:本研究将从以下三个问题入手,对环磷酰胺诱导的小鼠膀胱损伤后再生过程进行探究:1)小鼠膀胱黏膜层包含哪些细胞亚群?这些亚群又各自具有哪些特征和生物学功能?2)环磷酰胺诱导损伤后,小鼠膀胱上皮细胞是如何进行增殖、分化以完成膀胱上皮屏障的修复的?3)膀胱上皮细胞与固有层细胞之间具有哪些相互作用?哪些相互作用、哪些细胞亚群促进了膀胱上皮的再生?材料与方法:使用环磷酰胺诱导小鼠膀胱的急性与慢性损伤,随后撕取健康成体小鼠、急性及慢性膀胱损伤小鼠的膀胱黏膜层,消化成单细胞悬液,使用10×Genomics公司的3’端测序平台进行高通量单细胞转录组测序。使用聚类分析、基因差异表达分析、细胞轨迹推断等分析方法对测序数据进行分析,并结合免疫组化染色,小鼠谱系追踪实验以及小分子抑制剂体内给药实验解析膀胱上皮细胞的损伤后修复模式及固有层中的细胞是如何支持上皮细胞再生的。实验结果:在本研究中,我们获得了来自健康成体小鼠、环磷酰胺诱导的急性及慢性损伤小鼠膀胱黏膜层的共50404个细胞的高质量单细胞转录组数据。通过经典细胞标示物的表达情况,我们将这些细胞划分为六大类:尿路上皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞、内皮细胞、壁细胞以及自然杀伤细胞。随后,我们对其中的上皮细胞进行了再聚类,阐述了小鼠尿路上皮细胞的异质性,并发现了两群增殖细胞,分别为增殖的基底细胞与增殖的中间细胞,它们几乎都来自于损伤后的样本,尤其是急性损伤样本。免疫荧光染色实验验证了这两群增殖细胞的存在。通过对这两群细胞进行细胞周期分析、基因差异表达分析、GO分析以及转录因子活性分析,我们发现这两群增殖细胞在细胞周期进程上存在差异,并初步探索了造成差异的原因。接着我们又通过细胞轨迹推断以及小鼠谱系示踪实验揭示了增殖的中间细胞是膀胱修复过程中浅表细胞再生的直接祖细胞。随后,我们通过细胞间相互作用分析发现间充质细胞对膀胱上皮增殖的促进作用最强。通过再聚类分析、基因差异表达分析、转录因子活性分析以及免疫荧光染色,我们鉴定出了两群空间定位不同的间充质细胞亚群,分别为Acta2+肌成纤维细胞和Cd34+成纤维细胞。通过细胞间相互作用分析以及小分子抑制剂体内给药实验,我们进一步发现Acta2+肌成纤维细胞在急性损伤后上调Fgf7的表达,通过激活基底层/中间层祖细胞中的Fgfr信号,促进尿路上皮细胞的增殖和修复。研究结论:通过对健康成体小鼠、环磷酰胺诱导的急性及慢性损伤小鼠膀胱黏膜层的单细胞转录组测序数据进行分析,我们发现膀胱上皮的再生是由两群不同增殖状态的上皮细胞共同完成的,它们分别定位于基底层与中间层。其中,增殖的中间细胞通过不完全的细胞周期生成浅表细胞,是浅表细胞再生的直接组细胞。而固有层中的Acta2+肌成纤维细胞亚群通过分泌Bmp5、Fgf7以及Igf1等配体作用于上皮细胞而成为促进尿路上皮增殖、分化的微环境。科学意义:本研究从单细胞层面阐述了小鼠膀胱损伤后尿路上皮细胞的再生机制以及固有层中Acta2+肌成纤维细胞对尿路上皮再生的促进作用。我们的研究有助于更全面地了解环磷酰胺诱导的膀胱损伤修复过程中的细胞动力学,并有助于确定固有层中促进膀胱上皮再生的微环境及其作用方式,为膀胱再生提供新的线索。