卵巢衰老是从生殖成熟以后才开始或者加速的。它是一个具有普遍性、累积性、渐进性、内生性的生命的过程,是雌性生物的共同特征。围绝经期妇女最突出的变化是卵巢老化,重量减轻,卵巢体积减小,其表面皱缩不平及质地变硬,卵泡用尽或剩余卵泡对促性腺激素的刺激不敏感,合成与分泌性激素减少。目前,卵巢衰老有关的病因机制尚不完全明确,遗传因素、某些外来因素(如放疗、化疗、毒素、卵巢外伤或手术)、体内的内分泌因子、生长因子、细胞因子等因素都对卵巢衰老产生影响。卵巢的老化不但与神经-内分泌-免疫系统变化有关,且与其内在老化机制,步入围绝经期,卵巢会自主性失去器官功能,正常卵泡闭锁过程加快,或卵子被各种机制破坏,导致卵泡的耗竭,卵母细胞萎缩,卵巢颗粒细胞凋亡等有关。现代医学用于治疗卵巢衰老的药物主要有激素补充治疗、促排卵治疗、免疫抑制剂及赠卵治疗等,但均没有令人满意的疗效；激素替代疗法(HRT)由于疗程长,副作用大,且对乳房及雌激素靶器官存在潜在的危险,使患者体重增加,心里承受压力增大,恐惧致癌,等等。因此,越来越多的学者把目光转移至中医药对此病的研究、预防及治疗上。益妇宁(YFN)为治疗妇女围绝经期综合症的中药复方,该方由君药哈蟆油和臣药莪术组成,具有补肾益精,调和气血,消积祛浊之功效。已有动物实验和临床研究表明该方其具有抗氧化,抗衰老作用,能升高去卵巢模型大鼠血清E2水平,升高子宫、肾上腺指数,同时还可以调节免疫系统,下丘脑、垂体和血浆B-内啡肽、5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺含量。也就是说,YFN在作用于摘除卵巢的动物时,能通过改善下丘脑-垂体-性腺轴的神经内分泌功能,调节外周血激素水平,并且明显改善临床妇女围绝经期症状,那么YFN是否直接影响卵巢功能尚无证据。目的YFN为哈蟆油的复方,已有的细胞生物学实验及动物体内机制研究实验表明哈蟆油能促进卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌及细胞增殖作用,同时哈蟆油还能改善卵巢衰老的病理状态及下调细胞周期负性因子,因此,前期的实验基础为YFN治疗卵巢衰老提供了确切的实验依据。但目前对该方的研究尚缺乏有效成分的控制和该方对卵巢衰老作用的整体动物药效及机制的验证,所以本课题进行有效成分初步研究及整体药效研究,并结合前期细胞研究结果和动物药理研究结果进一步探讨其延缓大鼠卵巢衰老的作用机制,为本方治疗围绝经期卵巢衰老提供宏观水平的应用依据。方法1.益妇宁有效成分的初步研究采用考马斯亮蓝法及紫外分光光度法对测定YFN及君药哈蟆油中蛋白质及氨基酸含量。采用高效液相色谱法检测YFN和哈蟆油中有效成分雌二醇,1-甲基海因,亚油酸,维生素E及益妇宁中莪术醇含量。2.YFN延缓大鼠卵巢衰老的药效研究2.1动物模型的建立、分组及给药方法选取24只16-18个月龄自然老化的SD雌鼠模型。按体重随机分为老年对照组(O-C组)、阳性对照己烯雌酚片组(DT组,0.05mg/kg)、益妇宁高剂量组(YFN-H组,相当于含生药材2.0g/kg)、低剂量组(YFN-L组,相当于含生药材1.0g/kg),每组动物6只。另选3-4月龄SD大鼠6只作青年对照组(Y-C组)。连续灌胃给药6周。2.2标本的采集及研究方法(1)观察大鼠进食、饮水、毛色等一般情况及大鼠体重变化；采集标本前两周检测各组大鼠阴道上皮角化情况,计算动情周期天数；(2)末次给药后动物禁食12h,各组大鼠腹主动脉采血,分离血清,采用电化学发光法检测外周血清性激素指标雌二醇(E2)、睾酮(Te)、孕酮(P)含量；(3)剖取卵巢和子宫进行称重,计算脏器指数：脏器指数=组织湿重(mg)／体重(g)x100%；(3)各组大鼠卵巢、子宫、阴道组织用甲醛溶液固定,制作石蜡组织切片,通过HE染色观察卵巢、子宫、阴道等生殖器官组织病理学变化。3.YFN延缓大鼠卵巢衰老的机制研究3.1抗氧化作用机制(1)采用紫外分光光度法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)、过氧化氢(H202)的含量,并取肝组织冰浴匀浆,分别测定SOD、CAT活性和MDA、H2O2含量；(2)免疫组化检测卵巢组织中氧化应激蛋白p53及DNA损伤标记物8-OHdG的表达；(3)采用实时定量PCR (qRT-PCR)方法检测卵巢组织中谷胱甘肽过氧化物酶1(Gpxl)、过氧化物酶3(Prdx3)、谷氨酰胺酶2(Gls2)、锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)等抗氧化酶基因的转录水平。3.2促细胞增殖作用机制采用实时定量PCR (qRT-PCR)及Western blotting方法检测卵巢组织中细胞增殖负性调控因子p19、p53、p21、Rb基因和蛋白的表达；结果1.YFN有效成分检测结果表明,益妇宁中蛋白质含量为222.00±5.80mg/g,氨基酸含量为146.17±5.30mg/g,雌二醇含量为0.0031±0.0001mg/g,1-甲基海因为0.0528±0.0251mg/g,亚油酸为391.7333±2.7392mg/g,维生素E为0.1073±0.0096mg/g,莪术醇含量为1.1500±0.0014mg/g,哈蟆油中蛋白质含量为442.70±7.87mg/g,氨基酸含量为287.07±5.99mg/g,雌二醇含量为0.0071±0.0001mg/g,1-甲基海因为0.1257±0.0060mg/g,亚油酸为362.8100±4.3827mg/g,维生素E为.0.045±0.004mg/g,基本符合该复方的组成：哈蟆油含量约为42%,莪术油含量为10%。2YFN对衰老大鼠衰老体征、性激素指标和生殖器官组织形态学的影响2.1一般指征：与Y-C组比较,O-C组大鼠神态萎靡,活动较少,毛发脱落较明显,色泽暗发黄；DT组及YFN各组大鼠上述体征与O-C组比较均有所改善；且YFN-H、L组效果较DT组明显。体重结果：Y-C组大鼠的体重随着时间的增加而增重；O-C组大鼠体重变化不大,处于稳定的趋势,与Y-C组比较具有显著差异(P<0.05)；给药各组体重与O-C组比较,差异无显著性(P>0.05)。动情周期结果：O-C组大鼠动情周期紊乱,动情周期较Y-C组显著延长；DT组与YFN-H、L组能显著缩短衰老大鼠的动情周期(P<0.05),且’YFN-H组的作用效果更显著。卵巢指数结果：O-C组大鼠的卵巢指数与Y-C相比下降,但无统计学意义(P>0.05)；DT组卵巢指数与O-C组相比上升,但无统计学意义(P>0.05),而YFN-H组的能显著升高衰老大鼠卵巢指数(P<0.05)。子宫指数结果：O-C组大鼠的子宫指数与Y-C组相比显著降低(P<0.05),DT组及YFN-H组能显著升高衰老大鼠的子宫指数(P<0.05)。2.2性激素指标结果O-C组大鼠血清E2含量较Y-C组显著降低(P<0.05),DT组及YFN-H、L组能显著升高衰老大鼠血清E2含量(P<0.05)。O-C组大鼠血清Te含量较Y-C组显著降低(P<0.05),DT组及YFN-H、L组能显著升高衰老大鼠血清Te含量(P<0.05)。O-C组血清P含量较Y-C组降低,但无统计学差异(P>0.05),DT组血清P含量较O-C组下降,但无统计学差异(P>0.05),DT组血清P含量与Y-C组比较显著下降(P<0.05),YFN-H组血清P含量与O-C组比较升高,但无统计学差异(P>0.05), YFN-L组血清P含量与O-C组比较下降,但无统计学差异(P>0.05),但YFN-H、L组P含量与DT组相比仍显著升高(P<0.05)。2.3病理学结果2.3.1卵巢光镜观察：O-C组卵巢皮髓质结构清晰,以成熟卵泡为主,偶见少量初级、次级卵泡,各期卵泡数量较少,黄体发育正常,但与Y-C组相比黄体数目较少。DT组及YFN-H、L组卵巢皮髓质结构较O-C组清晰,初级及生长卵泡数量较多,可见成熟卵泡及排卵后形成的黄体,黄体数目增多。2.3.2子宫光镜观察：O-C组子宫各层比例较Y-C组明显改变,内膜层呈现明显萎缩变薄,细胞明显变小,胞浆少,核固缩,内膜层腺体分布明显减少,腺体有分泌现象的变少,腺腔扩大成囊,腺上皮扁平,胞浆少,毛细血管少,子宫浆膜层不明显。DT组及YFN-H、L组与O-C组相比子宫各层结构清晰,内膜增厚,腺体数目增加,腺体分泌现象增多,子宫浆膜层可见,毛细血管丰富增多,且DT组较YFN-H、L子宫内膜增厚明显。2.3.3阴道光镜观察：O-C组较Y-C组黏膜皱襞变少,复层扁平上皮明显变薄,浅层空洞状细胞变小,黏膜层变薄,固有层表层细胞浆呈嗜酸性,结缔组织变疏松,阴道分泌物明显减少。DT组及YFN-H、L组黏膜皱襞较O-C组增多,上皮细胞清晰,细胞数目增多,上皮浅层空洞状细胞变大,固有层结缔组织变致密,阴道腔分泌物的明显增加。YFN-L组黏膜皱襞较YFN-H组更多,黏膜层更厚,上皮结构更清晰,阴道腔分泌物更多,但YFN-H组固有层结缔组织明显较YFN-L组致密增厚,且YFN-H、L组比DT组黏膜层增厚明显。3. YFN延缓大鼠卵巢衰老的机制研究结果3.1抗氧化作用结果3.1.1血清抗氧化指标结果：O-C组血清SOD活性较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组及YFN-H、L组能显著升高衰老大鼠血清SOD活性(P<0.05),且YFN-H、L组的作用明显优于DT组(P<0.05)。O-C组血清GSH-Px活性较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组及YFN-H、L组血清GSH-Px活性与O-C组比较升高,但无统计学意义(P>0.05)。O-C组血清CAT活性较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组血清CAT活性与O-C组比无显著性差异(P>0.05),而YFN-H组能显著升高衰老大鼠血清CAT活性(P<0.05)。O-C组血清MDA含量较Y-C组显著升高(P<0.05),DT组血清MDA含量与O-C组相比无显著性差异(P>0.05), YFN-H、L组能显著降低衰老大鼠血清MDA含量(P<0.05),且YFN-H组的作用尤为明显。O-C组血清H202含量较Y-C组显著升高(P<0.05),而DT组及YFN-H、L组能显著降低血清H202含量(P<0.05),且YFN-H组的效果显著优于DT组(P<0.05)。3.1.2肝组织抗氧化结果：O-C组肝组织SOD活性较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组肝组织SOD活性与O-C组比较升高,但无统计学差异(P>0.05),YFN-H、L组能显著升高衰老大鼠肝组织SOD活性(P<0.05),且YFN-L组作用尤明显。O-C组肝组织CAT活性较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组及YFN-H、L组均能升高衰老大鼠肝组织CAT活性(P<0.05),YFN-H组效果显著优于YFN-L组,且均显著优于DT组(P<0.05)。O-C组肝组织MDA含量较Y-C组显著升高(P<0.05),DT组肝组织MDA含量与O-C组比较无显著性差异(P>0.05),而YFN-H、L组能显著降低衰老大鼠肝组织MDA含量(P<0.05),且’YFN-H组的效果优于YFN-L组。O-C组肝组织H202含量较Y-C组显著下降(P<0.05),DT组肝组织H202含量较O-C组显著升高(P<0.05),而YFN-H、L组肝组织H202含量与O-C组相比无显著差异(P>0.05),但显著低于DT组(P<0.05)。3.1.3实时定量PCR (qRT-PCR)检测结果O-C组卵巢组织GPX1、Prdx3、Mn-SOD基因的表达较Y-C组显著下降(P<0.05),但GLS2基因的表达与Y-C组比较无统计学差异(P>0.05),DT组及YFN-H、L组能显著升高衰老大鼠卵巢组织GPX1、Prdx3、GLS2、Mn-SOD基因的表达(P<0.05),且YFN-H、L组升高GPX1、Prdx3、GLS2基因的表达的作用优于DT组(P<0.05)。3.1.4免疫组化检测结果免疫组化结果显示大鼠卵巢组织中p53为胞核表达,阳性染色于各级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞、黄体细胞,黄体表达强于卵泡的表达；DNA损伤标志物8-OHdG为胞浆表达阳性染色主要于间质细胞的胞浆。O-C组卵巢组织p53蛋白IOD值较Y-C组显著升高(P<0.05),DT组及YFN-H、L组能显著降低衰老大鼠卵巢组织p53蛋白IOD值(P<0.05),YFN-H组作用尤明显优于YFN-L组,且均显著优于DT组(P<0.05)。O-C组卵巢组织8-OHdG蛋白IOD值较Y-C组显著升高(P<0.05),DT组及YFN-H、L组均能显著降低衰老大鼠卵巢组织8-OHdG蛋白的表达(P<0.05),YFN-L组作用尤明显,且显著优于DT组(P<0.05)。3.2促细胞增殖作用结果3.2.1qRT-PCR检测结果O-C组卵巢组织p19、p53、p21、Rb基因的表达较Y-C组比较显著升高(P<0.05), DT组及YFN-H、L组均能显著降低衰老大鼠卵巢组织p19、p53、 p21、Rb基因的表达(P<0.05),YFN-H组对p19、p53、p21基因表达降低的效果显著优于YFN-L组(P<0.05)。与DT组比较,YFN-H组对p21基因表达显著降低(P<0.05),而DT组对p19基因表达降低的效果优于YFN-H组(P<0.05)。3.2.2免疫印迹法检测结果O-C组卵巢组织p19、p53、p21、Rb蛋白的表达较Y-C组比较均显著升高(P<0.05),DT组及YFN-H、L组能显著降低衰老大鼠卵巢组织p19、p53、p21、Rb蛋白的表达(P<0.05), YFN-H组及DT组的效果显著优于YFN-L组(P<0.05),且YFN-H组对p19、p53蛋白作用效果还显著优于DT组(P<0.05)。结论1.YFN富含与提高机体免疫力和抗氧化有关的成分：蛋白质,氨基酸,雌二醇,1-甲基海因,亚油酸,维生素E,莪术醇等,可能是其治疗围绝经期综合征及卵巢衰老的主要有效成分。2.YFN对改善衰老大鼠的一般体征,恢复动情周期,调节外周血性激素分泌,提高卵巢、子宫的脏器指数,延缓自然衰老引起的大鼠卵巢、子宫、阴道等生殖器官的萎缩退变等具有积极作用,3.YFN具有抗氧化作用和促细胞增殖作用。YFN可能是通过发挥抗氧化及促增殖的作用延缓卵巢衰老,进而调节围绝经期综合征。