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本课题采用RAPD技术，调查呼吸道感染铜绿假单胞菌在张家口地区的流行情况，并将RAPD分型与耐药谱分型进行比较，同时对RAPD的反应体系进行优化，以期建立稳定的临床检测系统，并评价三代头孢(头孢哌酮、头孢他啶)与喹诺酮类(环丙沙星、左氧氟沙星)对乎吸道分离的铜绿假单胞菌体外联合效应，为临床用药提供实验依据。
研究方法：①标本收集及细菌鉴定、药敏试验：将取样的各种标本接种麦康凯选择培养基上，35℃培养箱培养48h。挑取氧化酶阳性、有金属光泽菌株，用非发酵/弧菌科生化药敏板进行鉴定及药敏，由微生物分析系统查询即可。②细菌DNA制备：将收集的湿菌体重悬于SE液中，加入SDS，60℃水浴10min：加入水饱和酚、氯仿-异戊醇，充分振摇脱蛋白质5min：8000r/min离心10min：吸出上层水相，加2倍体积的冰冷无水乙醇，用玻璃棒搅出丝状沉淀的DNA。等玻璃棒上的乙醇挥发干，将其溶于TE缓从液中，置4℃备用。③PCR反应体系组成与扩增条件：反应总体积为25μl，4种dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶2.5U，MgCL2浓度2.0mmol/L，引物浓度0.5μmol/L，模板浓度0.05ng/μl。将反应成分混合物置于PCR扩增仪中，94℃4min，(94℃40s，30℃40s，65℃2min)X35循环，72℃5min。(引物、镁离子、模板浓度、温度及循环参数值的确定采用单因素设计)④取扩增产物10μl，于15g/L琼脂糖凝胶电泳，恒压80V，2小时。⑤紫外透射仪下观测照相。⑥用微量液体稀释法测六种抗生素单用时对31株铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)，。⑦用微量液体平板棋盘法测出联合用药时对这些菌株的MIC，计算FIC指数。
研究结果：①本试验标本在同等条件下取自患者清晨深咳痰，共分离出31株铜绿假单胞菌，且多重耐药(对常规用药有4种以上抗生素耐药)达67.7％，我院的重症监护病房6株，“251”医院呼吸科病人5株，建国医院呼吸科病人2株，其余均分离自我院呼吸科病人。②31株铜绿假单胞菌依照抗生素耐药谱不同共分成6种型别，其中Ⅰ型共12株，占38.7％；Ⅱ型共5株，占16.1％；Ⅲ型共4株，占12.9％；Ⅳ型共3株，占9.7％；V型共3株，占9.7％；另有4株不定型(Ⅵ型)，占12.9％。实验表明，抗生素耐药谱为I型的菌株为优势菌株，且为多重耐药，是近一年来张家口地区呼吸道感染的铜绿假单胞菌的主要型别。③RAPD分型共有9种不同的基因型。其中基因A型17株，占54.8％；B型2株，占6.4％；C型3株，占9.7％；D型2株，占6.4％；E型2株，占6.4％；F型1株，占3.2％；G型1株，占3.2％；H型2株，占6.4％；I型1株，占3.2％；表明基因A型为优势菌株，是这一年来张家口地区呼吸道感染的相关菌株。④RAPD分型相同，耐药谱分型大致相同；而耐药谱分型相同，RAPD分型却可不同，表明耐药谱分型分辨力较低，可被RAPD进一步分型。⑤RAPD反应体系优化结果：引物浓度为0.5μmol/L时扩增效果最好；DNA模板浓度在0.50ng/μl、2ng/μl均得到了良好的扩增效果；镁离子浓度在2.0mmol/L、4.0mmol/L时扩增效果较好；退火温度：在30℃时扩增条带最清晰；循环参数：35、45个循环时扩增效果均好。⑥三代头孢(头孢哌酮、头孢他啶)和喹诺酮类(左氧氟沙星)联合用药对铜绿假单胞菌的体外抗菌作用协同作用为35.5～38.7％，相加作用为41.9～45.2％，无关作用为16.1～22.6％，无拮抗效应。
研究结论：①基因型A、耐药谱I型的铜绿假单胞菌是张家口地区这一年呼吸道感染的主要型别，其它均为散发。②RAPD分型的灵敏度、特异性及可靠性优于耐药谱分型，在流行病学调查中具有较大的应用价值。③本试验对RAPD反应条件进行优化，获得了较稳定的检测系统。④三代头孢(头孢哌酮、头孢他啶)和喹诺酮类(环丙沙星、左氧氟沙星)联合应用，对呼吸道分离的铜绿假单胞菌的体外抗菌作用以协同和相加为主，无拮抗效应。⑤对难治的呼吸道感染病人，迅速对其进行RAPD检测，并采取隔离及联合用药等措施，对提高临床治愈率具有很重要意义。