α-松油醇抗大肠杆菌机理研究

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α-松油醇是一种无色黏稠液体或低熔点透明结晶,具有紫丁香味,可应用于香精的配制及去臭剂,亦用于医药、塑料、肥皂、油墨工业中,又是玻璃器皿上色彩的溶剂。a-松油醇广泛存在于香樟树叶挥发油、互叶白千层叶挥发油、巨尾桉叶挥发油和油樟叶挥发油等中,其中四川产油樟叶挥发油中α-松油醇含量最高,为15.43%,香樟树叶挥发油、互叶白千层叶挥发油、巨尾桉叶挥发油中的α-松油醇含量分别为11.204%、3.93%和11.76%。为了充分利用油樟资源,本研究通过测定油樟叶挥发油中主要成分的抗菌活性大小,筛选出高效的抗菌成分,并且在细胞和分子水平上研究α-松油醇抗大肠杆菌机理。主要研究结果如下:1.油樟叶挥发油主要成分的抗大肠杆菌活性研究:测定油樟叶挥发油主要成分α-松油醇(98%)、1,8-桉叶油素(99.5%)、松油烯-4-醇(99%)和γ-松油烯(99%)的抗菌活性。采用二倍释法和沙氏琼脂平板稀释法测定油樟叶挥发油中主要成分的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC),利用平板菌落计数法绘制其抑菌曲线。结果表明,α-松油醇、1,8-桉叶油素、松油烯-4-醇和γ-松油烯对埃希氏大肠杆菌标准菌(CMCC(B)44102)的MIC和MBC值分别为0.78μL/mL和0.78μL/mL、6.25μL/mL和6.25μL/ml、1.56μL/mL和1.56μL/mL、>50μL/mL和>50μL/mL。上述结果表明,α-松油醇、松油烯-4-醇和1,8-桉叶油素对大肠杆菌均具有较好的抗菌效果,其中α-松油醇对大肠杆菌的抗菌活性最好且抗菌曲线呈现时间-浓度依赖型。2.α-松油醇对大肠杆菌形态结构与功能的影响:通过测定大肠杆菌壁膜间隙的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和细胞膜中的p-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)的活性来研究a-松油醇在MIC浓度下对大肠杆菌细胞壁和细胞膜通透性的影响;透射电子显微镜下观察α-松油醇在MIC浓度下对大肠杆菌超微结构的影响。结果表明,在120min后,大肠杆菌碱性磷酸酶活性逐渐上升,维持在14左右;在180min之后,大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性迅速上升,维持在30左右。电镜下对照组中的大肠杆菌形态正常,结构层次分明。在MIC浓度下,随着时间的推移,大肠杆菌细胞形态变小,形状不规则,结构层次混乱,细胞壁粗糙,细胞膜变薄甚至破裂,细胞质严重流失,核区浓缩、边聚。上述结果表明,α-松油醇影响细胞壁和细胞膜通透性;α-松油醇对大肠杆菌结构具有破坏作用。3.α-松油醇对大肠杆菌蛋白质和DNA合成的影响:通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验观察α-松油醇在不同浓度下对大肠杆菌蛋白谱带的影响;利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)核酸荧光染色法研究α-松油醇在不同浓度下对大肠杆菌DNA荧光强度的变化的影响。结果表明,α-松油醇在0.5MIC浓度下,大肠杆菌蛋白质谱带颜色随着时间推移而逐渐变深;α-松油醇在1MIC浓度下,16h后大肠杆菌蛋白质谱带颜色比对照组减弱;α-松油醇在2MIC浓度下,大肠杆菌蛋白质谱带颜色随时间的推移逐渐变浅。α-松油醇在0.5MIC浓度下作用16h后,大肠杆菌DNA荧光强度比对照组增强;在1MIC浓度下作用16h后,大肠杆菌DNA荧光强度变浅;在2MIC浓度下作用16h后,大肠杆菌DNA荧光强度明显变浅。上述结果表明,在1MIC浓度以上,α-松油醇对大肠杆菌蛋白和DNA的合成有较强的抑制作用。4.α-松油醇对大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharides, LPS)活性的影响:通过鲎试剂显色基质法定量测定α-松油醇体外降解大肠杆菌内毒素的作用;通过测定家兔肛温的方法来研究α-松油醇对大肠杆菌内毒素体内的作用。结果表明,α-松油醇浓度在0.1-0.39μL/mL之间时,大肠杆菌内毒素的分解率变化率不大;α-松油醇浓度在0.78-3.9μL/mL之间时,大肠杆菌内毒素分解率明显提高,并且随着α-松油醇浓度的增加而迅速升高。阴性对照组和实验组中家兔体温升高值没有超过0.6℃,每组中3只家兔体温升高值总和低于1.4℃;阳性对照组中3只家兔的体温升高值均超过0.6℃,且3只家兔体温升高值总和超过1.4℃,呈现典型的热原反应。上述实验表明,α-松油醇对大肠杆菌内毒素活性有抑制作用。
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