第一部分肝硬化患者艰难梭菌定植及感染状况分析艰难梭菌感染已经成为威胁人类健康的最重要的因素之一,高达20-30%的抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)和几乎所有的伪膜性肠炎(Pseudomembranous colitis,PMC)与艰难梭菌感染相关。艰难梭菌的定植患者是艰难梭菌感染(Clostrdium difficile infection,CDI)最重要的传染源。肝硬化患者往往因为伴有严重的并发症,如腹腔感染、消化道出血、肝性脑病等情况住院,需要使用制酸剂及抗感染药物,在抗生素压力及抑酸剂的作用下,可导致肠道菌群改变,引发CDI,严重患者出现PMC;无症状定植者及艰难梭菌感染患者是引起艰难梭菌的感染的重要传染源,对无症状定植者的研究为院内感染的预防提供理论依据。本部分研究主要目的在于明确肝硬化患者艰难梭菌定植及感染状况,分析肝硬化患者艰难梭菌定植的高危因素及定植与感染的相关性。本研究纳入526名肝硬化患者,留取粪便标本,检测艰难梭菌及毒素,并进行multilocus sequence typing(MLST)分型,根据肝硬化患者产毒素艰难梭菌定植的有无,将患者分成产毒素艰难梭菌定植组(Clostridium difficile colonized,CDC)和非定植组(Noncolonized,NC)。分析两组间性别、年龄大于60岁的比例、肝硬化的病因、多次住院、PTA下降、肝硬化并发症、抗生素使用情况的差异,通过多因素logistics回归分析明确艰难梭菌定植的高危因素;同时随访观察两组患者在住院过程中CDI的发生情况。研究结果发现:526名肝硬化患者粪便中,产毒素艰难梭菌阳性患者有104例,定植比率为19.8%,其中以ST-3、ST-54、ST-35、ST-37为优势菌株。多因素二元Logistics回归分析显示增加肝硬化患者艰难梭菌定植的危险因素有:CHILD分级C级(OR 3.025;95%CI 1.410-6.488),INR 升高(OR 2.180;95%CI 1.368-3.476),血小板下降(OR2.746;95%CI 0.931-8.103),并发肝性脑病(OR 1.740;95%CI 1.012-2.990)。在住院过程中,肝硬化患者艰难梭菌定植组比非定植组更容易发生CDI,分别为26.0%(27/104)和1.7%(7/422),P=0.000。本研究的结论:肝硬化患者产毒素艰难梭菌定植率为19.8%,CHILD分级C级、INR升高及PLT下降、并发肝性脑病是肝硬化患者艰难梭菌定植的高危因素,肝硬化患者艰难梭菌定植易于发展为CDI。第二部分肝硬化患者艰难梭菌感染的危险因素分析艰难梭菌是引起院内感染性腹泻最重要的原因,艰难梭菌感染与宿主的免疫状态、细菌毒力以及多种相关危险因素有关,这些危险因素包括老年、抗生素的应用、质子泵抑制剂或者抑酸剂的应用、鼻饲、胃肠道手术、基础疾病等。肝硬化或肝移植患者由于存在反复多次住院、住院时间的延长、抗生素以及抑酸剂等等诸多不利因素使得艰难梭菌感染在这些患者当中非常普遍。对肝硬化患者艰难梭菌感染的危险因素的认识有助于临床医生早期诊断与治疗,避免危险因素有助于减少院内CDI的发生。本部分研究的主要目的在于明确肝硬化患者艰难梭菌感染的危险因素。研究方法:从2015年5月到2015年10月共526名肝硬化住院患者纳入研究,纳入研究的患者入院时留取粪便检测艰难梭菌及毒素,住院过程监测是否发生艰难梭菌感染(CDI),发生CDI的患者为CDI组,未发生CDI的患者为NCDI组。研究发现有34例肝硬化患者在住院过程中发生了 CDI,分析年龄、性别、艰难梭菌定植、多次住院、住院时间延长、胆红素增高、血清肌酐增高、PTA下降、CHILD分级C、肝性脑病、肝肾综合征、上消化道出血、抗生素和PPI暴露等因素对肝硬化患者发生CDI的影响。研究结果表明:CDI组多次住院患者比例、入院时艰难梭菌定植患者比例明显高于NCDI组;CDI组平均住院时间明显大于NCDI组;CDI组生化学指标总胆红素和肌酐水平明显高于NCDI组;CDI组CHILD分级C、合并肝性脑病、肝肾综合征、上消化道出血的患者比例明显高于NCDI组;临床干预措施方面,CDI组抗生素暴露、碳青霉烯抗生素使用、质子泵抑制剂比例明显高于NCDI组。多因素二元logestic回归分析显示,年龄大于60岁(RR1.689;95%CI 1.135-3.128),多次住院史(RR 3.346;95%CI 1.392-8.043),低蛋白血症(RR 4.962;95%CI 2.053-11.996),入院时艰难梭菌的定植(RR 18.410;95%CI 6.898-49.136),合并肝性脑病(RR 1.357;95%CI0.954-2.368),住院时间超过 20天(RR 1.564;95%CI 0.989-2.563),抗生素暴露(RR 1.865;95%CI 0.889-2.863)及PPI暴露(RR3.125;95%CI 1.818-7.548)是肝硬化患者并发CDI的高危因素。我们的研究结论:年龄大于60岁,多次住院史,住院时间大于20天以上,低蛋白血症,入院时艰难梭菌的定植,合并肝性脑病,抗生素及PPI的暴露是肝硬化患者并发CDI的高危因素。应重视上诉危险因素的存在,提高肝硬化患者CDI的早期诊断率,降低肝硬化患者的病死率。第三部分肠道菌群结构多样性对肝硬化艰难梭菌携带患者发生CDI的机制研究CDI是院内感染性腹泻的最常见的原因。前期我们对526例肝硬化患者进行了随访研究,发现肝硬化患者艰难梭菌定植率为19.8%,高于其他住院病人艰难梭菌定植的比例。发现肝硬化患者CDI的发病率为6.46%(34/526),高于非肝硬化患者发生CDI的比例。健康人体肠道内存在成千上百种细菌,可以抵抗病原菌的侵入,能够拮抗艰难梭菌,从而使这些人群可以免受感染或者处于带菌状态。当某些危险因素存在的时候,如抗感染药物的使用,抑酸剂的使用,肠杆菌科细菌过度生长造成肠道正常菌群受到破坏,肠道微生态失衡,导致内毒素产生增加和肠黏膜屏障功能受损,甚至造成肠源性内毒素血症,肠道菌群的定植抗力下降,从而导致艰难梭菌定植患者发展成了 CDI,本研究基于肠道菌群结构多样性对肝硬化艰难梭菌携带患者发生CDI的机制进行深入研究,研究CDI患者在携带状态时候与其他患者之间肠道菌群结构的差异。本部分研究对肝硬化艰难梭菌携带的患者进行随访研究,入院时留取患者的粪便标本,进行艰难梭菌培养及毒素鉴定,并将标本分装冻存。艰难梭菌培养以及毒素检测阳性入组本研究,并根据住院过程中是否发展为CDI分为CDI组(艰难梭菌感染组)和NCD组(艰难梭菌携带组),并将肝硬化未携带艰难梭菌患者(Hepatocirrhosis,HC组)作为对照。利用Mesiq高通量测序平台对粪便标本中细菌16SrRNAV3区进行定性分析,比较入院时(均处于定植状态而未发生CDI时)两组患者肠道菌群结构多样性特征,探索艰难梭菌携带患者发生CDI的机制以及预警指标。研究发现CDI组的肠道菌群多样性指数sobs、ace等指数明显低于HC组。群落结构组分比较:在属水平上,发现CDI组的肠球菌属、埃希氏菌属数量明显多于NCD、HC组,CDI组拟杆菌属、乳酸菌属、双歧杆菌属的数量明显低于NCD和HC组。在门水平CDI组拟杆菌门和放线菌门数量明显低于NCD组和HC组,变形门菌数量明显高于NCD组和HC组。PCoA主坐标分析显示CDI组、NCD组、HC组各自聚集,区分良好。三组PCoA主坐标分析PCI、PC2和PC3解释率分别25.04%,9.35%和8.66%。CDI、NCD患者个体间离散程度较HC组明显,提示CDI、N CD患者肠道菌群结构个体差异大,而HC肠道菌群结构个体差异小。LEfSe分析显示:CDI组莫拉氏菌、Parabacteroides菌、不动杆菌、紫单胞菌科菌、Terrisporobacter明显高于其他组HC组和CDI组。NCD组梭状芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌科、拟杆菌科、拟杆菌属、疣微菌科、柔嫩梭菌、Hungatella、Intestinebacter明显高于HC组和CDI组。而HC组中无害梭菌、普雷沃氏菌科、巨型球菌属、霍氏真杆菌、红蝽菌科、红蝽菌属、毛螺菌属、Dorea等明显高于CDI组和NCD组。我们的研究结论是,肠道菌群结构的改变如莫拉氏菌、Parabacteroides菌、不动杆菌、紫单胞菌科菌等的增加以及拟杆菌、毛螺菌减少以及菌群多样性下降是CD携带患者发生CDI的机制,对并肝硬化患者CDI发生有着预警作用。拟杆菌、毛螺菌相对于存在比较健康的人群,今后可以进一步验证是否对CDI的发生有保护作用,甚至可以开发相关产品用于CDI的预防。