论文部分内容阅读
肝素(heparin)是由糖醛酸和D-葡萄糖胺组成的线性硫酸化多糖,具有抗凝血、调血脂等重要的生物学功能,具有广泛的医学临床应用。为解决传统的动物源肝素在原料收集和生产环节中易受污染的问题,满足全球市场对多类型肝素的巨大需求,开发非动物源肝素系列产品将对肝素的基础研究及其临床应用具有重要意义。非动物来源肝素主要有两种制备途径：一是以大肠杆菌K5发酵的肝素前体(heparosan)为底物,经化学和酶法修饰得到生物工程肝素；二是以二糖为起始底物经糖基转移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺(或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺)为单糖供体逐个添加单糖得到七糖骨架,并经化学和酶法修饰得到超低分子量肝素(Ultra-low molecular weight heparin, ULMWH)。但生产规模仅为毫克级别,距工业化生产还有很大的距离。主要的限制因素有1)肝素修饰酶硫磺基供体3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate, PAPS)价格昂贵且易分解,虽然酶法合成PAPS已经实现,但产量不高；2)肝素修饰酶的表达量低,很难大量获得；3)目前肝素制备均采用纯化后的游离酶进行反应,制备过程繁琐,价格昂贵,且不能重复使用；4)ULMWH生产所需的单糖供体UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA价格昂贵,产量不高。为了解决以上问题,本文开展了以下方面的研究工作：本文重组表达了三磷酸腺苷硫化酶和5’-腺苷磷酰硫酸激酶,构建了一条体外高效合成PAPS的途径。在最佳反应条件下,采用三磷酸腺苷分批补料策略,PAPS产量可达10.32 g/L,转化率为81.4%。通过密码子优化、与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein, MBP)融合表达以及表达条件优化等策略,在大肠杆菌中表达了C5异构化酶(C5 epimerase)、肝素2-O-磺基转移酶(heparan sulfate 2-O-sulfotransferase,2OST)、肝素6-O-磺基转移酶1 (heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1,6OST1)、肝素6-O-磺基转移酶3 (heparan sulfate 6-O-sulfotransferase3,60ST3)和肝素3-O-磺基转移酶1 (heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 1,3OST1)等酶法合成肝素关键酶,表达水平分别达到305、325、215、225和300 mg/L进一步研究了醛基化标签固定肝素修饰酶的方法。通过蛋白理性设计,将醛基化标签分别引入到MBP中的四处不同位置(E38H39, K170Y171, D209Y210和S352G353)。通过比较重组MBP表达量和对氨基树脂的吸附能力,发现D2O9Y210(pMAl-mbp7-FGE)获得最佳醛基化标签引入位点的融合配体MBP。利用绿色荧光蛋白和精氨酸水解酶作为报告蛋白,证实氨基树脂LX-1000HA对绿色荧光蛋白的结合率达90%,对精氨酸酶的结合率达71%。该固定化方法极大地提高了精氨酸酶操作稳定性,在使用14次之后仍保留了53%的活性。将该方法应用于肝素修饰酶,高效制备了五种肝素修饰酶的固定化酶。利用固定化肝素修饰酶建立了合成肝素的工艺路线。肝素前体经化学法脱乙酰基、加硫磺基后获得N-硫磺化肝素前体(N-sulfo heparosan)。以自制PAPS为硫磺基供体,利用固定化酶C5 epimerase,2OST、6OST1和60ST3对N-sulfo heparosan进行一锅法硫磺化修饰,然后利用固定化酶30ST1对上述反应物进一步硫磺化修饰得到生物工程肝素。经30ST1修饰得到的生物工程肝素具有抗凝血活性,效价可达到1.4 IU。采用强阴离子交换(SAX)-高效液相色谱(HPLC)对肝素结构进行分析,测定肝素经酶法裂解后所得各种二糖的含量。根据定量分析,Heparosan中IV-A占100%,N-sulfo heparosan中IV-A占8.26%,IV-S占91.74%。而猪源的肝素中,Ⅳ-A、IV-S、Ⅱ-A、Ⅲ-A、Ⅱ-S、Ⅲ-S、Ⅰ-A和I-S所占的比例分别为1.98%、2.14%、3.65%、1.10%、10.44%、5.64%、0.76%和74.29%。这一工作为进一步生物合成肝素结构鉴定奠定了基础。最后,通过重组表达N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷转移酶和无机焦磷酸水解酶,构建了一条体外高效合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA的途径。在优化的反应条件下,采用分批补料策略,UDP-GlcNAc的产量达到59.51 g/L,生产力达到4.03 g·L-1.h-1,转化率为92%；UDP-GlcNTFA的产量达到46.54 g/L,生产力达到3.32g·L-1·h·-1,转化率为75.5%。这一个工作为超低分子肝素关键前体生产提供了高效生产技术。