目的:喉癌是头颈部常见恶性肿瘤,尽管近年来治疗手段不断发展,喉癌的五年生存率仍为63%,且呈下降趋势。放疗是喉癌的主要治疗手段之一,放疗抵抗与局部肿瘤未控制是导致放疗失败的主要原因。染料木黄酮是一种大豆代谢的天然活性产物,流行病学调查显示大豆及大豆制品摄入丰富的亚洲人群比西方饮食人群前列腺癌及乳腺癌发病率低。研究表明,染料木黄酮通过诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制肿瘤侵袭和转移等途径发挥抗癌效应,因其广泛的抗肿瘤效应具有开发价值。课题组的前期工作发现,染料木黄酮对喉癌HEp-2细胞的增殖有明显的剂量依赖性的抑制作用;诱导凋亡;抑制PI3K/Akt信号传导通路;抑制细胞侵袭等途径发挥抗癌作用。近年来的体内外研究表明染料木黄酮具有增强乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等癌症放射敏感性的特性。目前,关于染料木黄酮是否增强喉癌放射敏感性的研究尚未见报道。本研究通过喉癌细胞体外实验研究染料木黄酮对HEp-2细胞系放射敏感性的影响,并从中探讨可能的分子机制。为进一步的动物模型体内研究提供基础。方法:1 CCK-8实验检测不同浓度的染料木黄酮对HEp-2细胞24,48,72h增殖的影响。2克隆形成实验检测染料木黄酮对HEp-2细胞长期的增殖影响,并且联合放疗,检测染料木黄酮预处理后对HEp-2细胞存活率的影响,并拟合细胞存活曲线数学模型探究染料木黄酮对其放疗敏感性的影响。3 Ed U免疫荧光检测染料木黄酮与放疗对HEp-2细胞DNA合成增殖的作用。4γ-H2AX foci免疫荧光法检测染料木黄酮联合放疗对DNA双链断裂损伤的影响。5流式细胞术检测染料木黄酮和放疗对HEp-2细胞周期的影响。6 Western blot检测细胞周期调节蛋白p Chk2、p Chk1和cdc2以及PI3K/Akt信号传导通路蛋白的表达。结果:1染料木黄酮抑制HEp-2细胞生长,呈剂量依赖性,24h,48h,72h的HEp-2细胞生长抑制率随剂量增加而增高。2染料木黄酮对细胞生长的长期效应有抑制作用。10到100μM的染料木黄酮对细胞产生剂量依赖性的克隆形成抑制效应。较低浓度10μM染料木黄酮对HEp-2细胞存活率(survival fraction,SF)无影响,25μM染料木黄酮细胞存活率SF约50%。3染料木黄酮增强X线照射后HEp-2细胞生存分数抑制。拟合细胞存活曲线多靶单击模型,10μM和25μM染料木黄酮预处理组与单纯放疗组相比细胞存活率显著下降。计算各生存曲线的放射生物学参数,10、25μM染料木黄酮的放射增敏比(Sensitization enhancement ratio,SER)为1.26和1.48,染料木黄酮增强HEp-2细胞放射敏感性。4染料木黄酮与放疗协同抑制HEp-2细胞增殖。1Gy/5μM染料木黄酮,1Gy/25μM染料木黄酮,4Gy/5μM染料木黄酮和4Gy/25μM染料木黄酮联合,计算细胞增殖期比例,E/O值为1.04,1.23,1.23和1.21,染料木黄酮与放疗协同抑制HEp-2细胞增殖。5染料木黄酮增强X线对HEp-2细胞诱导的DNA损伤并抑制修复。X线照射24h后,单纯放疗的γ-H2AX foci数目/细胞相比1h照射后foci数目明显下降,而染料木黄酮联合放疗foci数目1h显著增加,且24h仍维持,并未显著下降。6染料木黄酮诱导HEp-2细胞周期G2/M期阻滞,呈剂量时间依赖。在24h,48h和96h各时间点,随着染料木黄酮剂量加大,处于G2/M期细胞比例加大。此外,染料木黄酮作用后72h,96h Sub-G1期细胞比例加大,出现凋亡峰。7染料木黄酮诱导X线照射后HEp-2细胞周期G2/M期阻滞及细胞周期调节蛋白激活。放疗24h后,染料木黄酮预处理组G2/M期细胞比例逐渐增大,增强放疗诱导的G2/M期阻滞。与单纯放疗Rad相比,染料木黄酮预处理和放疗结合,细胞周期调节蛋白p-Chk2和p Chk1明显上调。8染料木黄酮和放疗抑制HEp-2细胞PI3K信号通路蛋白表达。染料木黄酮预处理和放疗结合,p Akt蛋白明显下调,p-PTEN蛋白明显上调。结论:1染料木黄酮增强喉癌HEp-2细胞放射敏感性。2染料木黄酮与放疗协同抑制HEp-2细胞DNA合成增殖。3染料木黄酮与放疗结合增强放疗诱导的DNA损伤并抑制修复。4染料木黄酮与放疗结合增强放疗诱导的G2/M细胞周期阻滞,激活细胞周期调节蛋白。5染料木黄酮与放疗结合抑制PI3K/Akt信号传导通路。