背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验与临床研究,使人们对脑缺血性损害及其药物干预等的认识不断深化,针对该病不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性强的治疗靶点和策略势所必然。 目前,对脑缺血/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、线粒体的损伤、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,再灌注时的炎症反应促进了继发性脑损害,是脑缺血/再灌注损伤的主要原因之一。同时发现,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC)受损是脑血管病特别是脑缺血发病的早期病变和基本诱因,与脑血管病发生发展密切相关,因此保护BMEC 的功能和结构显得尤其重要。活化的 BMEC 在转录因子,特别是核转录因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)系统的调节下,产生一系列细胞因子、酶类等介质,介导或直接参与白细胞和 BMEC 的相互作用以及血管、组织的损伤。多数学者认为 NF-κB 是炎症反应的中心环节。靶向 NF-κB 的抗炎治疗成为国内外众多学者研究的热点。 人 工 合 成 的 NF- κ B 圈 套 寡 脱 氧 核 苷 酸 (NF- κ B decoy oligodeoxynucleiotides 或NF-κB decoy ODNs)是含有NF-κB 结合位点的双螺旋寡核苷酸。当NF-κB从NF-κB-IκB复合物中解离出来以后,NF-κB decoy ODNs即可与游离的NF-κB结合,从而封闭了NF-κB,阻断其向核内移位及启动靶基因的转录。圈套策略以其特异性及高效性有着其它策略无可比拟的优势,成为一种新型的基因治疗方案。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 4同时也发现 NF-κB decoy ODNs 在体内滞留时间短、易被细胞内外核酸酶降解以及靶向进入细胞核内量少等问题。其后果是成本昂贵且细胞毒性作用大。而且众所周知,血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的存在也限制了神经药物或用于基因治疗的核苷酸片段进入颅内,使其不能发挥有效的治疗作用。因此,在中枢神经系统疾病时,寻找一种新方法使药物能顺利通过 BBB 达到病变部分,发挥其治疗作用,已经成为医学研究中急需解决的难题。纳米粒作为靶向制剂的载体是近年来研究的热点。载药纳米粒经过适当的修饰,可有效解决 decoy ODNs 易被核酸酶降解的问题,进而可通过 BBB,把药物定向输送到中枢神经系统而发挥治疗作用。目的:(1) 探讨大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascularendothelial cells, BMEC)的培养方法并对之进行形态学观察;(2) 制备大小均匀、带正电荷、包封率高、血管内皮细胞摄入率高的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(polybutylcyanoacrylate nanoparticles,PBCA NP); (3) 建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation, OGD)/复氧(reoxygenation)模型;(4) 通过该模型,研究 BMEC 在氧糖剥夺/复氧后 NF-κB p65 蛋白的表达、活化的动态规律;(5) 研究靶向 NF-κB 的哑铃形寡脱氧核苷酸(decoy ODNs)- PBCANP 复合物转染血管内皮细胞在该模型条件下对细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取 Wistar 大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胶原酶消化、离心等技术获取脑微血管内皮细胞并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用 MTT 方法测定生长曲线;采用透射电镜、光散射、粒径仪、流式细胞仪、荧光显微镜等研究和评价 PBCA NP 的重庆医科大学硕士研究生学位论文 5理化特征、粒径、载基因能力以及该纳米粒载特异性基因的脑靶向性;采用细胞培养、MTT 法、酶学检查、光学显微镜、透射电镜及测氧仪等研究和评价氧糖剥夺模型;采用转染、免疫细胞化学和 RT-PCR 方法研究 NF-κB 的动态变化及 NF-κB decoy ODNs-PBCA NP 复合物对其靶基因蛋白表达的影响。结果:(1) 经形态学、免疫细胞化学鉴定所培养的细胞为 BMEC ;(2) 制备了平均粒径为 70 nm、粒径分散度为 0.19、带正电荷的PBCA NP;(3) decoy ODNs-PBCA NP 复合物在 BMEC 中的分布:荧光显微镜观察到转染 30min 细胞内便有荧光标记的 decoy ODNs 出现,随着时间的延长,细胞内的荧光越来越强,转染 6h-8h 荧光强度最强,18h 仍然有荧光信号存在。开始荧光信号主要分布于细胞外及胞浆,然后逐渐进入细胞核。分别以 PBCA NP 和脂质体为载体时,通过流式细胞仪检测到细胞内的荧光总量分别增加了 213 倍和 64 倍,显示出 NP 作为载体较脂质体为载体的转染效率高;(4) OGD 过程中,培养液的氧浓度平稳地维持在极低水平,与缺氧前比较,具有显著性差异(P<0.05);OGD 前后细胞形态结构变化显著,乳酸脱氢酶的释放量均提示细胞损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P<0.05);(5) 免疫细胞化学显示BMEC的NF-κB p65蛋白表达在OGD4h时,开始明显增加(P<0.05);R2h-R8h 逐渐增加达到高峰(P<0.05);R12h 时有所下降,但仍高于正常组(P<0.05);R24h 时进一步下降,与正常组无显著性差异(P>0.05)。NF-κB 核转位细胞 R8h 达到高峰,?