鸡腺胃炎病原的分离及Real-time PCR检测IBV在各器官的表达

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2011-2012年肉鸡和蛋鸡腺胃炎发病率较高,该病在中国大部分省份均有发生和流行,给养鸡业造成了严重的经济损失。加强对该病检测方法的研究,对控制传染性病毒性腺胃炎病的发生,保护和促进养鸡业的健康发展具有重要意义。自腺胃炎发生以来,关于腺胃炎的病因仍然众说纷纭,本研究在临床上遇到的传染性病毒性腺胃炎病例中分离出了传染性支气管炎病毒(IBV)。不同发病程度的患病鸡的剖检变化不同,对于病因不详的病毒性疾病,弄清楚病毒侵害的主要靶器官对于该病的预防和治疗起着至关重要的作用。因此笔者应用实时荧光定量PCR的方法对患病鸡的胸腺、肺脏、心脏、腺胃、肾脏、肝脏、脑等器官中病毒的含量做定量分析并进行差异显著性分析。将连续盲传八代的尿囊液进行直接血凝试验,病毒无血凝性,用1%磷脂酶C处理后有血凝性。也通过对NDV的干扰实验及RTPCR实验初步鉴定该病毒为传染性支气管炎病毒。首先针对IBV-N基因序列设计了一对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增出216bp的目的片段,同时参照已往发表的文献合成一对扩增内参基因的β-actin引物,大小为139bp。将这两个扩增的目的片段分别与pEASY-T1Cloning Vector重组,将重组质粒分别命名为pEASY-T1-N和pEASY-T1-β-actin。将两个重组质粒酶切鉴定、测序成功后作为标准品,进行荧光定量PCR标准曲线的建立。实验结果显示:标准曲线线性关系R2值为0.9972和0.9983,相关性极好,检测极限为1.0E+02拷贝。对腺胃炎病例各器官进行RNA的提取,以cDNA为模板进行荧光定量PCR,将测得的Ct值代入标准曲线公式计算出N基因和β-actin基因的拷贝数,然后根据公式:IBV-N相对表达量=IBV-N拷贝数/β-actin拷贝数计算IBV-N的相对含量。用已建立的方法对临床样品检测,结果显示腺胃中病毒的相对含量最高;肾脏次之,与肺脏差异不显著,与其他器官差异显著,肺脏居第三,与肝脏、肾脏差异不显著,与其他器官具有显著性差异。肝脏居第四,与腺胃、胸腺、肾脏差异显著,与其他器官差异不显著。心脏、脑与肝脏差异不显著,与其他器官差异显著。胸腺中RNA的表达量最低,与其他器官具有显著性差异。因此可以得出,临床表现为腺胃炎的病例,IBV感染时主要的侵害靶器官为腺胃。
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