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目的:子痫前期是妊娠期特有的一种多系统性的进展性疾病,严重影响了母婴健康,是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因之一。滋养细胞浸润不良和螺旋小动脉重塑障碍导致胎盘缺血缺氧是目前公认的发病原因,但其具体的发病机制仍不清楚。生物钟基因普遍存在于生物界,调控着我们的生物节律。有研究发现生物钟基因可能与妊娠期间的激素分泌和胎盘发育相关。Clock作为生物钟的核心基因,不仅在胎盘中的表达存在近日节律,而且与多种肿瘤细胞的侵袭能力相关。滋养细胞的浸润能力与肿瘤细胞的侵袭能力相似,且差别在于其可控性。有研究证明子痫前期与滋养细胞的浸润和生物节律相关,我们有理由认为生物钟基因Clock可能在子痫前期的发病机制中发挥重要作用。另有研究发现体内缺氧应答通路由生物钟基因组监控,HIF-1α与Clock蛋白结构相似,同属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH,basic-he-lix-loop-helix)家族,是联系缺氧调节通路与生物钟调控的核心调节节点。因此,我们认为可能是缺氧诱导的生物钟基因Clock通过调控胎盘滋养细胞的生物学行为参与了子痫前期的发病过程。本研究拟通过人胎盘组织、氯化钴(CoCl2)诱导的滋养细胞缺氧模型和子宫低灌注子痫前期大鼠模型,研究Clock基因与缺氧以及子痫前期的关系。方法:1.选取2017年8月至2018年12月在中国医科大学附属盛京医院产科病房分娩的70例孕产妇作为实验对象(其中早发型子痫前期组20例,早发对照组10例,晚发型子痫前期组20例,晚发对照组20例),收集胎盘组织并处理。采用实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR,quantitative real-time polymerase chain reaction)法、免疫印迹(Western Blot)法和免疫组织化学法检测早发型子痫前期胎盘,晚发型子痫前期胎盘及相应对照组胎盘组织中生物钟基因Clock mRNA和蛋白的表达。2.选择稳定传代的滋养细胞系HTR-8/SVneo进行实验。通过检测HIF-1α的表达确定CoCl2诱导滋养细胞缺氧模型的最适浓度。通过血清休克同步化滋养细胞中生物钟基因的节律,检测缺氧后Clock mRNA和蛋白的表达变化及96小时内的表达节律。通过细胞划痕、Matrigel侵袭小室实验和MTT法,检测缺氧组和正常组滋养细胞的迁移、浸润和增殖能力的差异。将si-Clock干扰序列导入滋养细胞缺氧模型中,再次检测细胞迁移、浸润和增殖能力的变化,验证si-Clock对缺氧的逆转作用。3.通过缩窄腹主动脉和一侧子宫动脉的方法构建子宫低灌注子痫前期大鼠模型,对照组只分离动脉不缩窄,收集造模组和对照组孕鼠的胎盘组织,通过RT-qPCR、western blot和免疫组化检测Clock mRNA和蛋白的表达。通过胎盘定点注射慢病毒的方法过表达造模组孕鼠胎盘组织中的Clock,检测孕鼠血压及尿蛋白的改变,验证Clock对子痫前期大鼠模型的逆转作用。4.收集同步化后的缺氧滋养细胞和正常组滋养细胞,提取蛋白后,通过免疫沉淀(IP,Immunoprecipitation)检测与Clock蛋白结合的SUMO-1蛋白的表达差异。收集造模组和对照组孕鼠的胎盘组织,提取蛋白后通过IP检测与Clock蛋白结合的SUMO-1蛋白的表达差异。结果:1.RT-qPCR检测到Clock m RNA在早发型和晚发型子痫前期胎盘组织中表达明显高于相应的对照组,而western blot和免疫组化结果显示Clock蛋白表达明显低于对照组。2.分别用终浓度为0、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM的含CoCl2的培养基培养HTR-8/SVneo,检测发现200μM组细胞HIF-1α蛋白表达增高最明显。说明CoCl2可诱导细胞缺氧,最适浓度为200μM。缺氧后Clock mRNA表达增高,而蛋白表达降低。Clock mRNA的表达具有节律性,且缺氧后节律时间变短,但在96h内蛋白表达节律不明显。使用浓度为200μM CoCl2的培养液诱导滋养细胞系HTR-8/SVneo缺氧后,与正常对照组细胞的生物学行为进行比较,结果显示细胞缺氧后,迁移、浸润和增殖能力均下降。使用si-Clock逆转缺氧对滋养细胞生物学行为的影响,结果显示si-Clock组的细胞迁移能力、浸润能力以及增殖能力均有改善。3.HIF-1α在子宫低灌注的子痫前期模型大鼠胎盘中的表达要明显高于对照组。子痫前期模型大鼠胎盘中Clock mRNA的表达明显低于对照组,而蛋白要明显高于对照组。胎盘定点注射慢病毒过表达Clock的表达后,子痫前期模型大鼠的血压改变量,24小时尿蛋白及胎盘吸收率均有明显改善。4.缺氧后的滋养细胞中Clock蛋白的SUMO化水平明显高于正常组。子宫低灌注的子痫前期模型大鼠胎盘中Clock蛋白的SUMO化水平明显低于正常组。结论:1.早发型和晚发型子痫前期胎盘组织中Clock mRNA的表达增高,蛋白表达降低,Clock可能与子痫前期的发病相关。2.可能是缺氧诱导Clock的表达和节律改变,影响了滋养细胞的生物学行为。3.Clock可能参与了大鼠滋养细胞的浸润和胎盘发育过程,并影响了血压和尿蛋白的改变。4.可能是SUMO化影响了Clock蛋白的稳定性,导致Clock mRNA和蛋白的表达不一致。