龙须菜的附生菌群分析及其对病变的抗氧化响应研究

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近年来,随着我国东南沿海龙须菜养殖规模的持续扩大,各类病虫害的发生日趋严重,而有关大型海藻病害机制的基础研究较为薄弱,防治手段有限,阻碍了养殖生产的进一步发展。藻类病害通常是环境因子、病原菌及藻体应激响应综合作用的结果,且往往与海藻表面附生菌有关,因此进行大型海藻表面附生菌群分析,开展藻体对病害的应激响应的研究有助于深入了解病害发生的机制,对维持大型海藻养殖业的可持续发展具有重要的意义。  本研究以07-2品系龙须菜为实验材料,提取自然情况下代表病变程度不同的健康、病间、白化组织的附生菌DNA,经PCR扩增16S rDNA基因的V3可变区并进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分离V3片段,再对目的条带进行克隆鉴定。实验结果数据化后计算附生菌多样性指数比较群落多样性,进行多维尺度分析(nMDS)及多元梯度分析(RDA)来比较群落组成相似性及优势菌群。nMDS分析结果表明:病变程度不同的组织,附生菌群的相似度是不同的,病间组织与健康组织相似度高,而白化组织差异较大。随着病变程度的加深,活细菌数目以及菌群多样性逐渐增加。由此可见:病害的发生会影响到菌群的组成,发病组织的附生菌群组成更为复杂。RDA分析结果表明:α-变形菌纲(α-Proteobacteria)在各个组织中均有分布,在健康组织中所占的比例较高,主要有根瘤菌属(Rhizobiales)、红螺菌属(Rhodobacterales)、红杆菌属(Rhodospirilaes)、玫瑰变色菌属(Roseovarius sp)以及鲁杰氏属(Ruegeria)等。γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)中的交替单胞属(Alteromonadaceae)、噬琼胶菌属(Agarivorans gilvus)和Bowmanella属等与病间组织密切相关。与白化组织相关的菌属信息较少,没有鉴定到。  采用微生物传统培养方法从白化藻体分离到13株附生菌,主要为放线菌纲的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans,编号G4)、表皮短杆菌属(Brevibacterium,编号W5)、短杆菌(Brachybacterium,编号Gw)芽孢杆菌属(Bacillus,编号Y2、Y7)、甲基杆菌属(Methylobacterium,编号 Y11)和库克菌属(Kocuria,编号 P7),γ-变形菌纲的白色噬琼胶菌(Agarivorans albus,编号 MQ)、交替单胞菌属(Alteromonas,编号Y15),属于α-变形菌门的微小杆菌(Ochrobacterium sp,编号W10)、(Kopriimonas,编号 W46),及拟杆菌纲的(Aquimarina,编号 W2)属和(Zobellia,编号Y46)。采用针刺的方式将这些菌接种入龙须菜藻体,进行回复感染,发现中有3株菌具有较为稳定的致病能力,分别为MQ、Y15、W2,并且均有琼胶酶活性。白化部位还有一些结合较为紧密的菌群,难以洗脱下来,经鉴定部分含有在健康藻体也存在的玫瑰变色菌属(Roseovarius sp)。由此可见:藻体在健康与发病状态下,其表面附生优势菌群是不同的,在特定环境下,其中一些可使藻体细胞壁降解的产琼胶酶细菌有可能成为致病菌,并使藻体发生白化等病变。  此外,当室内培养的龙须菜出现局部白化病症后,取健康、病间、以及白化部位的组织,测定过氧化氢(H2O2)及丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)及过氧化氢酶(CAT)活性,并提取可溶性蛋白进行活性电泳(Native-PAGE)及过氧化物酶(POD)同工酶染色,比较龙须菜病变过程中藻体组织内活性氧含量及其抗氧化响应,结果表明:H2O2以及MDA含量在病间组织最高,且显著高于白化组,健康组最低;病间组CAT稍低与健康组,差异不显著,而白化组CAT活性急剧下降,与其他组相比,差异极显著;病间组T-AOC最高,健康组稍低,白化组最低,但三组之间差异不显著;POD随着病变程度加重,酶活性逐渐增加。由此可见:发病初期藻体病间组织会产生大量活性氧,之后藻体抗氧化系统特别是POD酶起到了清除活性氧的作用。  对上述藻体可溶性蛋白进行活性电泳时意外发现藻红蛋白有降解现象,且经质谱鉴定其主要降解片段为藻红蛋白β亚基。为此,进一步测定藻胆蛋白含量及纯度,发现病间组藻胆蛋白含量和纯度与健康组相比下降达80%,而白化组变化幅度更大,说明龙须菜在出现肉眼可见的白化病症之前,藻胆蛋白就已经开始降解。待白化病症出现之后藻胆蛋白降解程度增大,机体受损伤严重。因此,藻胆蛋白对病害非常敏感,藻胆蛋白含量与结构的变化可以反应藻体组织病变的程度。另外一方面,作为光合色素,藻红蛋白降解对光合作用可能有影响。为此,进一步测定藻体光量子效率Fv/Fm,结果表明:病间组Fv/Fm稍高于健康组,而白化组显著降低。由此可见,藻体随着白化程度增加其光合效率显著减弱,而病间藻体光合效率略有增强,藻胆蛋白结构有可能发生结构重组,这可能与藻体初期抵抗病原菌的入侵有关。
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