谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成机制的解析及关键基因的表达

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lqlq2323
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脂肪酸是一种重要的平台化合物,可进一步合成高能比生物燃料和高附加值油脂化学品。谷氨酸棒杆菌是公认的食品级安全菌株,具有Ⅰ型脂肪酸合成系统,不含脂肪酸降解的β氧化途径,拥有脂肪酸合成的潜力。本研究以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为细胞模型,以强化脂肪酸的合成为目标,收集其对数期至稳定期菌体样本进行转录组学分析,揭示谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成机制,为进一步的研究提供新方向。谷氨酸棒杆菌中脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸合成中的关键酶。利用生物信息学分析脂肪酸合成酶FasA的理化性质、结构域等信息,在确定其在基因水平上的可操作性后,构建FasA重组载体,同时构建乙酰辅酶A羧化酶AccBCD1重组载体,通过同源和异源表达,研究FasA和AccBCD1对宿主菌脂肪酸代谢产生的影响,达到提高脂肪酸合成量的目的。主要研究结果如下:(1)通过转录组学分析得出,12 h时菌株以指数形式增长,酶系活跃,代谢旺盛。16-20 h之间是谷氨酸棒杆菌的重要节点,其生长、催化等过程开始停滞,进入快速的次级代谢产物生成期。与脂肪酸合成有关的基因表达量在12 h-16 h之间达到最大值。脂肪酸生物合成途径的相关基因在16 h后开始出现下调,此时脂肪酸降解途径的相关基因开始上调;20 h时,脂肪酸降解基因持续上调的同时,脂质代谢途径的相关基因也开始上调;24 h时,脂肪酸生物合成基因显著下调,甘油磷脂和甘油酯代谢等脂质代谢途径的相关基因开始下调,脂质代谢进入了尾声阶段,生物被膜开始形成。(2)通过生物信息学分析得出,FasA蛋白分子式为C13944H22067N3855O4353S55,分子量为315128.12 Da,由2969个氨基酸组成,没有跨膜结构域,不属于分泌蛋白,是定位于细胞质中的可溶性大型复合酶,拥有6个结构域,其中3-氧代酰基-ACP合成酶结构域和热狗结构域具有催化合成不饱和脂肪酸的功能。(3)通过基因工程手段构建了FasA的异源表达和同源表达菌株,异源表达菌株总脂肪酸产量约为98.1 mg/g细胞干重,同对照菌株相比提高了14.76%。过表达FasA显著提高了大肠杆菌的C16:1(棕榈油酸)和C18:1(油酸)含量,分别为19.3 mg/g、23.3 mg/g细胞干重,与对照菌株相比分别提高了6.46和14.08倍。同源表达菌株的脂肪酸总产量变化不大,约为61.0 mg/g细胞干重,FasA的同源表达使C18:1下降了42.71%,使C18:0提升了4.59倍。(4)通过基因工程手段构建了AccBCD1的异源表达和同源表达菌株,异源表达菌株的总脂肪酸产量达到了132.4 mg/g细胞干重,比对照菌株增加了57.24%,其中C16:0、C16:1、C18:1脂肪酸的含量显著提高,与对照菌株相比分别增加了1.22倍、8.78倍、26.96倍。AccBCD1的过表达对大肠杆菌的脂肪酸组成产生了显著的影响。同源表达菌株的脂肪酸含量与对照菌株相比,C16:0提高了27.94%,而C18:1含量下降了18.56%,工程菌株的总脂肪酸含量为54.0 mg/g细胞干重。
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