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干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)是一种细胞因子,它具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗细菌感染的生物学活性。其可调节天然免疫和后天免疫,以及一些非特异性因子共同抵御病毒感染机体。近些年来,中国和同本的灵长目猕猴属动物中大规模爆发犬瘟热感染。这表明CDV打破物种间的壁垒,从非灵长类动物扩散到非人灵长类的猴,使其公共卫生学意义更加突出。然而目前恒河猴传染病的防治仍以药物控制为主,市场上并无专用疫苗,加之动物专用的干扰素还处于临床应用的初级阶段,这些因素给恒河猴犬瘟热疾病的预防和控治带来了更大的困难。因此迫切需要研究新的防治技术和药物来加强恒河猴的饲养管理。一个相对有效的拯救措施是通过IFN-γ来提高恒河猴的免疫力。本试验通过提取恒河猴外周血淋巴细胞中的总RNA,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增得到恒河猴IFN-y基因,并将其克隆到pGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,克隆得到IFN-y基因开放阅读框由498个核昔酸组成,编码一个由166个氨基酸组成的多肽。用双酶切连接目的基因IFN-y和表达载体pET32a,转化到大肠杆菌构建原核表达载体pET32a-IFN-γ,鉴定成功后转化到大肠杆菌BL21(表达菌株)。IPTG诱导表达后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,然后进行重组菌的诱导表达及最佳表达条件的确定并进行原核表达产物的纯化。对纯化后的重组IFN-γ蛋白,采用淋巴细胞增殖试验和间接ELISA测定其免疫活性,并在细胞水平上检测重组IFN-γ对CDV感染的抑制作用。研究结果如下:1.本试验应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从恒河猴外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到恒河猴-γ干扰素基因,并将其克隆到pGEM-T载体中。测序结果表明,本试验克隆得到的恒河猴IFN-y基因大小为498 bp,编码166个氨基酸。与GenBank发布的11种相关动物的IFN-γ核苷酸序列进行比较,恒河猴与食蟹猴的核苷酸同源性最高为100%,不存在种间差异。2.将IFN-y基因连接原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-IFN-γ并转化大肠杆菌BL21(表达菌株),经SDS-PAGE和Western-blot分析,重组菌最佳表达条件为37℃,0.05mMol/LIPTG诱导表达8h,主要以包涵体形式存在,分子量约为 35.4 kD。利用 HiTrapTM Chelating HP column(GE Healthcare)镍柱的亲和层析进行蛋白纯化,得到纯化的目的蛋白浓度为0.2mg/mL。3.对纯化后的重组IFN-y蛋白,采用淋巴细胞增殖试验和间接ELISA试验测定其免疫活性。结果表明,重组蛋白具有刺激T细胞增殖效应,并且在一定范围内呈量效正相关,同时能够刺激恒河猴外周血淋巴细胞分泌IFN-γ,说明其具有天然蛋白的免疫活性。实时荧光定量PCR检测重组蛋白体外抗CDV结果表明,重组的IFN-γ蛋白在2倍稀释时抗CDV增殖的作用最明显,并随着稀释加倍,对CDV的抑制作用减小。综上所述,本研究成功克隆了恒河猴IFN-y基因,构建了 pET32a-IFN-γ原核表达质粒,其表达产物具有较高的免疫活性和体外抗病毒活性。本研究结果为下一步开发出恒河猴病毒类疾病的治疗制剂,并用于恒河猴临床疾病治疗奠定了一定的基础。