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众所周知,细胞周期进程受到非常精细的调控,细胞周期异常,尤其是G1/S时相转换失控是癌变的关键步骤。至今,已有大量的细胞周期调控蛋白被鉴定。近年来,新发现的一类小分子非编码RNA——microRNAs(miRNAs),具有强大的调控蛋白表达的作用。这些小分子RNA在细胞周期调控网络中的生物学功能尚不清楚。我们通过芯片检测,发现了一批在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中差异表达的miRNAs,并进一步采用生物信息学方法预测这些miRNAs的潜在靶基因,发现miR-195和miR-26的靶基因中富集了调控G1/S时相转换的蛋白。因此,在本论文中,我们阐述了miR-195和miR-26在细胞周期调控中的作用及其分子机制,发现:1)miR-195通过抑制pRb上游的分子(cyclin D1和CDK6)和pRb下游的转录因子(E2F3),调控G1/S时相的转换。首先,利用流式细胞术,我们发现过表达miR-195可抑制细胞周期G1/S期的转换,而沉默miR-195则可促进细胞周期的进程。其次,双萤光报告基因系统及western blot实验表明miR-195可直接抑制cyclin D1、CDK6和E2F3这三个G1/S期转换相关基因的表达;而且miR-195可明显降低pRb蛋白的磷酸化及E2F3下游靶基因的转录激活。这些结果揭示miR-195可通过负调控cyclin D1、CDK6和E2F3,阻断细胞周期G1/S时相的转换;而且,它具有“自动防故障装置”的作用,可防止pRb信号通路异常所导致的E2F3活性增高及细胞异常增殖。2)内含子编码的miR-26a/b家族与其宿主蛋白家族CTDSP1/2/L通过协同激活pRb蛋白,共同实现对G1/S时相转换的阻断作用。miR-26家族包括miR-26a和miR-26b,它们分别从miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b基因位点转录,而miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b分别定位于CTDSP蛋白家族成员CTDSPL、CTDSP2和CTDSP1的内含子。利用成纤维细胞血清饥饿释放和肝再生这两个细胞周期研究的经典模型,我们发现miR-26a/b与CTDSP1/2/L具有相同的表达趋势,即在静息的细胞中表达水平较高,而在细胞增殖过程中表达趋于下调。同时,miR-26a/b与CTDSP1/2/L的表达水平在HCC组织中明显低于其相应癌旁组织,并且miR-26a/b的表达分别与其对应宿主基因的水平呈正相关。以上结果表明,在生理和病理情况下miR-26a/b与其宿主基因CTDSP1/2/L共表达。进一步的功能获得及缺失实验证实,miR-26与其宿主蛋白CTDSP1/2/L均具有抑制细胞G1/S时相转换的功能,而且具有协同效应。机制研究表明,miR-26通过直接抑制CDK6和G1期相关cyclin的表达,CTDSP1/2/L则通过促进ppRb的去磷酸化,来共同激活pRb蛋白,以实现它们对细胞周期的协同抑制作用。这些结果揭示miR-26与其宿主基因可提供双重保障系统,协同抑制G1/S时相的转换,防止细胞异常增殖。综上所述,本论文的研究结果不仅揭示了细胞周期调控网络的新机制,也为肿瘤防治提供了新的分子靶点。