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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起,其大规模的爆发给养猪业造成巨大的经济损失。PEDV属冠状病毒科α冠状病毒属,其基因组为单股正链RNA,编码非结构蛋白1A/1B和结构蛋白S、E、M、N。Orf3是位于PEDV s基因和e基因之间的第三阅读框,是目前发现的PEDV的唯一一个附属基因,编码ORF3蛋白,有关其功能是PEDV的研究热点之一。兽医界普遍认为其与PEDV的毒力相关,但在现有的研究中,受研究手段的限制,对其生物学作用和机理还了解不多。本研究的研究内容及结果如下:（1）3株重组病毒的拯救及鉴定。通过构建带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组质粒,利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作系统拯救3株携带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV,终末稀释法纯化病毒,并经RT-PCR法和免疫组化对获得的重组病毒进行鉴定。RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV;进一步的免疫组化分析结果证实重组PEDV的ORF3蛋白存在于其感染的Vero细胞中。（2）病毒生长曲线的绘制。将获得的重组PEDV及实验室已保存的重组病毒rDR13att-ORF3wt和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞,分别于感染的第8、16、24、32、40、48h后,反复冻融3次,测定其TCID50并绘制以病毒感染时间为横坐标,TCID50为纵坐标的病毒生长曲线。测得的TCID50经SPSS分析表明携带有orf3基因的PEDV滴度(TCID50)显著高于缺失orf3基因的重组PEDV（p<0.05）。（3）5株病毒感染细胞不同时间测定残留细胞数量。方法一:全自动细胞计数分析仪计数。将获得的重组PEDV及实验室已保存的重组病毒rDR13att-ORF3wt和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞,分别在感染25和36h利用全自动细胞计数分析仪对感染后的残留活细胞进行计数。结果表明携带有orf3基因的PEDV感染Vero细胞25和36h时测的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组PEDV（p<0.05）。方法二:CCK-8试剂盒测定病毒感染后残留活细胞数量。将获得的重组PEDV及实验室已保存的重组病毒rDR13att-ORF3wt和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞,并于感染后的第12、24、36、48h测定病毒感染后Vero细胞OD450值。SPSS分析表明,病毒感染Vero细胞12h时,5株病毒感染的Vero细胞OD450值差异并不显著;病毒感染24和48h后带有orf3基因的重组病毒活细胞OD450值显著高于orf3基因缺失的重组PEDV（p<0.05）,而在病毒感染36h后结果相似,但差异达极显著（p<0.01）。此结果进一步验证了细胞计数仪检测的结果。（4）细胞活性的测定。将获得的重组PEDV及实验室已保存的重组病毒rDR13att-ORF3wt和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞,并于感染后的第12、24、36、48h测定病毒感染后Vero细胞OD450值。根据细胞活力计算公式将测得的OD450计算为细胞活力,其结果经SPSS分析显示,病毒感染Vero细胞12h时,5株病毒感染的Vero细胞活性差异并不显著,感染24、48h时,带有orf3基因的重组病毒残留活细胞的细胞活性值显著高于orf3基因缺失的重组PEDV（p<0.05）,而在病毒感染36h后结果相似,但差异达极显著（p<0.01）。通过以上试验研究ORF3蛋白对PEDV体外增殖的影响及作用机制,我们得出结论:ORF3蛋白促进PEDV在Vero细胞中的增殖,该作用是通过延缓或减少感染细胞的死亡实现的。本研究为揭示PEDV orf3基因的功能和PEDV复制机制的研究提供理论基础。