禽流感病毒（AIV）在世界范围内尤其在亚洲广泛流行,不仅给家禽业带来巨大的危害,还可以跨过宿主屏障感染人,在人类公共卫生安全上具有重要意义。本研究拟结合目前流感病毒表达外源基因的方法,选取mCherry荧光基因和NanoLuc荧光素酶基因作为报告基因,对H9N2亚型禽流感病毒（A/chicken/Guangdong/V/2008）的NS基因进行改造,分别构建携带mCherry和NanoLuc报告基因的重组H9N2亚型AIV,前者用于建立快速筛选有效的抗流感病毒药物的方法,后者通过生物发光成像的方法实时监测流感病毒在小鼠体内的感染动态过程。NS基因能编码NS1蛋白和NEP蛋白,首先分别扩增编码NS1蛋白和NEP蛋白的基因序列,在NS1基因序列后面分别插入mCherry和Nano Lcu报告基因序列,报告基因序列与NEP基因序列中间连接着能被蛋白酶识别切割的PTV-1 2A肽序列,构建NS基因重组质粒,然后通过反向遗传技术获得VK627-mCherry与VK627-NanoLuc重组病毒。在SPF鸡胚传代中,收集的4代病毒液都能检测到报告基因;Western-Blot结果表明重组病毒NS1蛋白和报告蛋白以融合的形式表达;荧光和间接免疫荧光方法检测到重组病毒mCherry红色荧光蛋白的表达;重组病毒的增殖曲线测定结果发现重组病毒的复制能力与亲本毒株相近。前期试验结果表明,成功拯救出携带mCherry和NanoLuc报告基因的重组H9N2亚型AIV,重组病毒具有良好的稳定性和较好的复制能力,而且能表达具有活性的报告蛋白。VK627-mCherry重组病毒感染MDCK细胞后,加入已知有抗流感作用的药物利巴韦林,随着药物浓度的升高,重组病毒的荧光强度逐渐减弱,当利巴韦林药物浓度达到50μM时,观察到重组病毒荧光完全消失,结果表明可根据重组病毒的荧光情况快速筛选有效的抗流感病毒药物。VK627-NanoLuc重组病毒通过滴鼻感染小鼠后,从小鼠眼眶注射NanoLuc荧光素酶底物,置于活体成像仪观察,活体小鼠的胸部可检测到生物荧光信号,荧光强度与感染剂量相关,随着感染剂量的升高,在小鼠体内检测到的荧光强度越强,并通过生物发光成像这方法实时监测了流感病毒在小鼠体内的感染动态过程。将VK627-NanoLuc重组病毒PB2蛋白627氨基酸位点由K突变成E时,在小鼠胸部检测到的生物荧光强度显著降低,同时发现对小鼠的致病力也显著下降,与已知流感病毒PB2蛋白627氨基酸位点对小鼠致病力的影响结果一致,表明携带NanoLuc报告基因的重组病毒也可用于快速评估影响流感病毒跨宿主传播或致病力的关键位点。综上所述,携带mCherry荧光基因的重组病毒为筛选有效的抗流感病毒药物提供了一种快速检验的方法,对新型抗流感病毒药物的研发、筛选和生产具有一定的指导意义;携带NanoLuc荧光素酶基因的重组病毒在小鼠体内成像的应用能实时监测流感病毒在机体的分布情况及感染动态过程,对流感病毒感染、致病性及致病机制研究具有重要意义。VK627-mCherry与VK627-NanoLuc重组病毒为流感病毒的研究补充了一种可视化工具。