研究背景:乳腺癌对于我国女性来说是很大的威胁,每年新生和死亡人数分别占世界的12.2%和9.6%。随着医学科学的发展,乳腺癌的诊治已经有了比较大的进步,获得了很高的治愈率和生存率。但是乳腺癌患者仍然有高复发率和转移率。乳腺癌的内科治疗包括化疗、内分泌治疗和靶向治疗。近几年来,乳腺癌靶向治疗已成为临床研究的热点话题,其临床应用明显提高了乳腺癌的诊疗效果。已经针对不同的乳腺癌亚型开发了越来越多的靶向疗法。这些药物的临床应用改善了乳腺癌的治疗效果,并不断改变乳腺癌的临床实践过程。如何克服癌症的耐药性,开发出能够超越传统靶向药物疗效的新药,是未来的重要研究方向。MYC是一个强大的原癌基因,原发于Burkitt淋巴瘤t(8;14)(q24;q32)染色体中发现。MYC是螺旋亮氨酸拉链家族成员,和它的其他家族成员N-MYC、L-MY C一样,都是转录因子。MYC是以核定位序列,螺旋-环-螺旋二聚区域,DNA结合区域和转录调节区域为基础发挥其功能作用。正常细胞中,MYC原癌基因在转录水平、转录后水平、细胞周期检验点和染色体有丝分裂中严格受多种调控机制和信号转导通路等调控。这些严格调控机制使细胞不能发生癌变,而目前为止MYC是最频繁失调控的致癌基因之一。在50%的人类癌症中,MYC家族致癌基因存在调节失控,这往往与患者不良预后和生存不利有关。MYC几乎在致癌过程的每个方面都发挥着重要作用,协调增殖、凋亡、分化和代谢。尽管抑制MYC是治疗多种癌症的有效方法,但由于其蛋白结构不可药物化,直接靶向MYC已经是一个挑战。因此,为了达到理想的抗肿瘤效果,人们广泛探索MYC阻断的替代方案,包括MYC/Max复合物阻断、MYC转录和/或翻译抑制、MYC失稳以及与MYC过表达相关的合成致病性。MYC调控异常引起的细胞凋亡是一种重要的调节机制,在预防致瘤细胞增殖中起着非常重要的作用。致癌基因MYC诱导的细胞凋亡是通过p53依赖和非p53依赖途径发生的,其机制尚不清楚。p53基因在约50%的人类恶性肿瘤中存在突变,p53抑制肿瘤活性的丧失与细胞周期阻滞和细胞凋亡密切有关。有报道提出,p53缺失引起的DN A修复过程的缺失与在p53缺失小鼠中观察到的高癌症易感性相关。MYC在乳腺癌组织中的扩增率大约30%。大量基础研究数据表明,原癌基因MYC的扩增在乳腺癌发病机制中具有重要作用,但其扩增频率和在人类研究中的预后相关性并不一致。有研究显示,MYC扩增与已知预后因素的关系(肿瘤分级、淋巴结转移、激素受体阴性)有显著的相关性;扩增与复发和死亡风险显著相关。由此可见,MYC失调可导致乳腺癌的发生和进展,并与不良预后相关。因此,靶向MYC调控通路可为乳腺癌治疗提供一种有前途的策略。我们研究的目的就是希望了解MYC与乳腺癌临床病理特征,预后的相关性并初步探讨其在p53缺失的乳腺癌细胞中的作用机制。研究目的:1、检测乳腺癌组织中MYC的表达,分析其与临床病理因素,复发转移的关系,探讨MYC与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移的关系;2、观察野生型MYC和突变型MYC(T58A)对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其原因;3、借助体外RNAi沉默基因技术探讨MYC基因通过调节上游基因p14,p21从而调控非p53依赖性凋亡的重要因子Bim的机制。材料和方法:1、检测MYC过表达和乳腺癌临床病理特征及复发转移的关系(1)选取并收集2013年6月至2014年1月青岛大学附属医院收治的100位浸润性乳腺癌患者癌组织及癌旁组织样本。(2)免疫组化检测分析组织标本中MYC的表达。(3)收集整理临床病理数据资料,将MYC的表达情况与临床病理因素进行相关性分析;分析MYC与乳腺癌5年DFS的关系。2、观察MYC野生型及突变型(T58A)对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响(1)分别应用携带MYC野生型及突变型(T58A)慢病毒载体介导转染p53缺失的HCC1937乳腺癌细胞。(2)采用菌落形成法和MTT法检测MYC野生型及突变型(T58A)对乳腺癌细胞增殖的影响。(3)流式细胞仪测凋亡法和TUNEL法检测MYC野生型及突变型(T58A)对乳腺癌细胞凋亡的影响。3、分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用(1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测MYC、Bim mRNA和蛋白水平的表达,分析MYC野生型及突变型(T58A)对乳腺癌细胞增殖和凋亡调控的作用机制。(2)RT-PCR和Western blot检测MYC和Bim信号通路中p14、p21的mRNA和蛋白的表达水平。(3)借助体外RNAi沉默基因技术干扰p21的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p21的表达水平。(4)采用菌落形成法和MTT法检测干扰p21后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。(5)借助体外RNAi沉默基因技术干扰p14的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p14的表达水平。(6)采用菌落形成法和MTT法检测干扰p14后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。结果:1、免疫组化结果显示MYC在乳腺癌组织中的阳性率为36%(36/100);在癌旁正常组织中,阳性率为12%(12/100);MYC在癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织,二者比较有统计学意义(p<0.05)。2、MYC阳性表达与乳腺癌的年龄不相关,在小于等于50岁的患者中,阳性率为37.2%(16/43),在大于50岁的患者中,阳性率为35.1%(20/57),二者差别无统计学意义(p=0.827)。3、MYC阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径相关,在小于等于2cm的患者中,阳性率为25%(12/48),而在大于2cm的患者中,阳性率为46%(24/52),MYC在肿瘤直接大于2cm的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义(p=0.028)。4、MYC阳性表达与乳腺癌的TNM分期相关,在分期为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为26.8%(15/56),而分期为Ⅲ的患者中,阳性率为47.7%(21/44);MYC在分期越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义(p=0.030)。5、MYC阳性表达与乳腺癌的细胞学分级相关,在分级为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为27.6%(16/58),而分级为Ⅲ的患者中,阳性率为47.6%(20/42),MYC在分级越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义(p=0.039)。6、MYC阳性表达与乳腺癌的ER状态相关,在ER阳性的患者中,阳性率为25%(15/60),而ER阴性的患者中,阳性率为52.5%(21/40),MYC在ER阴性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义(p=0.005)。7、MYC阳性表达与乳腺癌的HER状态相关,在HER2阳性的患者中,阳性率为48.6%(18/37),而HER2阴性的患者中,阳性率为28.6%(18/63),MYC在HER2阳性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义(p=0.043)。8、MYC阳性表达与乳腺癌的淋巴结状态无关,在淋巴结阳性的患者中,阳性率为43.1%(25/58),而淋巴结阴性的患者中,阳性率为26.1%(11/42),二者差别无统计学意义(p=0.082)。9、MYC阳性表达与乳腺癌的术后复发转移相关,在5年内复发的患者中,阳性率为60%(12/20),而5年内未复发的患者中,阳性率为29.2%(24/80);MYC阳性患者具有更高的复发风险,二者差别有统计学意义(p=0.012)。10、MYC阳性表达与乳腺癌的p53表达无关,在p53表达阳性的患者中,阳性率为39.6%(21/53),而p53表达阴性的患者中,阳性率为31.9%(15/47),二者差别无统计学意义(p=0.642)。11、MYC野生型及突变型(T58A)成功转染p53缺失的HCC1937细胞。两者较对照组均能诱导细胞增殖(p<0.01);野生型同时能够诱导细胞凋亡(p<0.01),而突变型不能诱导凋亡(p>0.05)。12、RT-PCR和Western blot结果显示,MYC野生型转染组细胞Bim表达水平升高(p<0.01)。MYC突变型(T58A)转染组细胞Bim与对照组表达无明显差异(p>0.05)。13、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21表达水平下降(p<0.01),Bim表达水平升高(p<0.01);RNAi沉默p21后,Bim表达水平较沉默前更高(p<0.01)。MYC突变型(T58A)成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21及Bim表达水平均没有发生变化(p>0.05),同时转染T58A并RNAi沉默p21后,Bim表达水平与单纯沉默p21无明显差异(p>0.05)。14、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14表达水平升高(p<0.01),同时Bim表达水平升高(p<0.01);RNAi沉默p14后,Bim表达水平较沉默前降低(p<0.01)。MYC突变型(T58A)成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14及Bim表达水平均没有发生变化(p>0.05),同时转染T58A并RNAi沉默p14后,Bim表达水平与单纯什么p14无明显差异(p>0.05)。结论:1、MYC在乳腺癌组织中的高表达与肿瘤直径、细胞学分级、病理分期、激素受体状态、HER2状态有关;且MYC阳性患者5年内复发转移风险增高,表明MYC阳性表达与乳腺癌预后相关。2、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC可以促进细胞增殖和凋亡,而MYC发生突变后,仅能促进细胞增殖,却不能促进凋亡。3、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC通过MYC/p21/Bim及MYC/p14/Bim这两种信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥调控作用;MYC突变后,不能调控p21、p14,进一步不能调控Bim参与细胞凋亡的调控。