研究背景和目的血管内皮细胞遍布机体全身,其功能的异常不仅导致血管疾病,还会引发多种重大退行性疾病,如神经退行性疾病、糖尿病和自身免疫性疾病等。血管内皮细胞的自噬和凋亡是影响血管内皮功能的重要因素,两者之间具有密切的关联,但是其关联的分子机制尚未搞清,研究清楚血管内皮细胞自噬和凋亡的关系及其关联的分子机理,确定能抑制其凋亡的关键因子和信号通路对防治血管相关疾病具有重要意义。细胞自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,其中巨自噬(以下简称为自噬)在细胞命运控制中发挥重要作用,与细胞凋亡的关系密切。细胞自噬具有明显的细胞特异性,目前有关细胞自噬的研究多集中于肿瘤细胞和血清饥饿诱导的自噬,而对血管内皮细胞自噬调控机制了解较少,特别是对血管内皮自噬与凋亡的关系了解更少。细胞自噬和凋亡的信号通路之间存在对话,在某些情况下自噬与凋亡相互协同促进细胞走向死亡,而在另外一些情况下自噬能够抑制凋亡而促进细胞存活。在此过程中,有些调节因子能同时控制这两个过程。但是,在血管内皮细胞中,关联自噬和凋亡的关键因子是什么?启动血管内皮细胞自噬和凋亡的分子开关和信号通路又有哪些?这些都是急需要解决的重要科学问题。在我们实验室的前期工作中,发现在血管内皮细胞的凋亡过程中,伴随着integrin β4蛋白水平及位置的变化;另外integrin β4参与镉离子诱导的血管内皮细胞自噬过程。因此,我们推断integrinβ4可能是关联血管内皮细胞凋亡和自噬的关键因子。但是,integrin β4关联血管内皮细胞凋亡和自噬的具体机制还不清楚,即integrinβ4在什么情况下促进自噬、抑制凋亡,在什么条件促进凋亡以及促进凋亡机制是什么均需要深入研究。先前的研究表明,integrin β4细胞质结构域中1494位酪氨酸的磷酸化在介导其下游信号转导中具有重要作用,并且能够控制integrinβ4其它位点的磷酸化和其细胞定位。在血管内皮细胞凋亡中,该位点是否能够发生磷酸化以及是否与integrinβ4亚细胞定位的改变有关还不清楚。神经鞘氨醇磷酸胆碱由神经鞘磷脂的分解产生,是一类重要的心血管调节因子;SPC主要是以与高密度脂蛋白结合的形式存在于血浆中。SPC是对血管内皮细胞生理功能具有重要调控作用的内源性因子,但是,SPC是否通过integrinβ4调节血管内皮细胞的凋亡和自噬尚未搞清。化学生物学的应用可为阐明生命科学问题提供重要实验依据,我们筛选到一种化学小分子能够诱导integrinβ4入核,并促进血管内皮细胞凋亡,这为我们深入研究integrinβ4在细胞内的定位机制以及调控血管内皮细胞凋亡的分子机制提供了新的有力工具。针对上述科学问题,本论文深入研究了 integrin β4在SPC诱导的血管内皮细胞自噬中的作用和作用机制;以吡唑环氧烷衍生物ECPC和31-S为工具,深入研究了 integrinβ4入核及其调控血管内皮细胞凋亡的分子机制,通过本研究,为阐明SPC调控血管内皮细胞功能的分子机制提供了新的实验证据,发现了integrin β4的入核及其调控血管内皮细胞凋亡的新机制,为心血管病的防治提供了新的线索和理论依据。研究内容1.研究在去除血清和生长因子条件下神经鞘氨醇磷酸胆碱诱导血管内皮细胞自噬并抑制其凋亡作用。2.研究神经鞘氨醇磷酸胆碱通过integrinβ4诱导血管内皮细胞自噬的作用机理。3.以吡唑环氧烷衍生物ECPC为工具,研究integrin β4入核及其调控血管内皮细胞凋亡的分子机制。4.筛选到手性吡唑环氧烷衍生物31-S,进一步研究integrinβ4入核的机制。研究方法1.血管内皮细胞的分离、培养:引用Jaffe等人的方法[1]。2.细胞自噬和自噬流的检测:1)利用Western blot法检测LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平,分析自噬小体的数量以及自噬流的完整性。2)免疫荧光法检测自噬标志物MAP1 LC3蛋白在细胞内的定量和分布。3)利用自噬抑制剂3MA以检测SPC引发的自噬和自噬流。4)利用ATG5 siRNA干扰掉ATG5的表达,SPC刺激之后,Western blot法检测LC3-Ⅱ的蛋白水平。3.细胞凋亡检测:1)倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。2)MTT,SRB法检测内皮细胞存活率。3)利用Hochest33258、TUNEL方法检测细胞凋亡率。4)Western blot检测PARP的切割情况。5)荧光探针JC-1检测线粒体膜电位。6)荧光探针DCHF检测ROS变化。4.磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c(PC-PLC)活性检测:参考吴兴中等人的方法[2]。5.利用RNA干扰技术降低蛋白表达水平:利用化学合成的siRNA特异性阻断血管内皮细胞中ATG5、integrin p4、FGFR1的表达。6.利用真核细胞过表达系统特异性上调蛋白表达:利用含integrin β4全长的野生型或者将1494位点酪氨酸突变为丙氨酸的突变型表达载体pCMV6-XL5-integrin β4特异性上调血管内皮细胞和HEK 293细胞中integrinβ4的蛋白表达水平。7.利用基因芯片技术检测基因的变化情况。8.利用免疫共沉淀检测integrin β4与FGFR1是否具有相互作用。9.细胞内蛋白分布及表达水平检测:1)利用免疫荧光染色法结合激光扫描共聚焦显微镜检测p53、integrinβ4蛋白的表达水平及分布。2)利用 qPCR 方法检测细胞内 KITLG、PTGS2、ATF3、IL-8、GAPDH 的 mRNA水平。3)利用 Western blot 方法检测 LC3、p62、ATG5、p53、integrin β4、FGFR1、KITLG、PTGS2、ATF3、IL-8、1494 位点酪氨酸发生磷酸化的 integrin β4、PARP、GAPDH、β-actin蛋白的表达水平。4)分离得到细胞核与非细胞核蛋白,结合Western blot方法检测integrin β4蛋白的分布情况。研究结果1.神经鞘氨醇磷酸胆碱诱导血管内皮细胞自噬并抑制其凋亡作用的分子机制研究1.1神经鞘氨醇磷酸胆碱诱导血管内皮细胞自噬并抑制去除血清和生长因子引起的细胞凋亡我们首先利用MTT检测细胞的存活率,发现神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)能够抑制去除血清和生长因子诱导的细胞存活率的下降;并且Hoechst 33258染色检测到SPC能够抑制细胞的凋亡。自噬和凋亡之间存在联系,因此我们检测了 SPC对自噬的影响。利用Western blot和免疫荧光检测在SPC刺激之后,细胞发生自噬时多个marker的变化情况,实验结果显示SPC诱导血管内皮细胞自噬的发生。1.2神经鞘氨醇磷酸胆碱诱导血管内皮细胞自噬的分子机制研究我们之前的研究结果表明integrin β4能够调节肺癌A549细胞和镉离子诱导的内皮细胞的自噬,在本实验中我们检测到在SPC诱导的内皮细胞自噬过程中,integrin β4的蛋白水平是下降的;并且PC-PLC酶活性、p53的蛋白水平均是下降的。利用siRNA干扰、过表达integrin β4发现SPC能够通过integrin β4调节自噬的发生,p53,PC-PLC是integrin β4的下游分子。2.以吡唑环氧烷衍生物ECPC为工具,研究integrin β4入核及其调控血管内皮细胞凋亡的分子机制2.1吡唑环氧烷衍生物ECPC通过integrin β 4促进去血清和生长因子诱导的血管内皮细胞凋亡我们发现在去血清去生长因子条件下,ECPC处理之后细胞形态变圆,SRB结果显示细胞存活率下降;Western blot检测到PARP发生切割,并且TUNEL分析显示DNA发生片段化,因此ECPC引起血管内皮细胞发生凋亡。利用siRNA干扰掉integrin β4的表达之后能够抑制ECPC诱导的凋亡。因此,ECPC通过integrin β4诱导内皮细胞凋亡的发生。2.2 Integrin β4参与ECPC诱导的血管内皮细胞凋亡的分子机制我们首先检测integrin β4细胞质结构域1494位点酪氨酸(Y-1494)的磷酸化情况,ECPC能够增加Y-1494位点的磷酸化。我们利用免疫荧光发现ECPC能够诱导integrin β4发生细胞核位移;并且ECPC通过诱导integrinβ4进入细胞核增加了与炎症和凋亡相关基因:KITLG,IL-8,PTGS2和ATF3的表达。利用FGF-2预处理之后能够抑制ECPC诱导的integrin β4 Y-1494磷酸化,之后我们发现在去除血清和生长因子条件下,FGFR1 siRNA抑制EPCP诱导的该位点的磷酸化。利用免疫共沉淀检测到ECPC处理增加FGFR1和integrinβ4的相互作用,并且FGFR1能够直接磷酸化integrinβ4 Y-1494位点。因此FGFR1调节了 integrinβ4 Y-1494的磷酸化。FGF-2抑制integrinβ4磷酸化之后能够抑制其细胞核位移过程;并且抑制KITLG,IL-8,PTGS2和ATF3的表达。3.利用手性的吡唑环氧烷衍生物进一步研究integrin β4入核的分子机制3.1筛选到手性吡唑环氧烷衍生物31-S诱导integrin p4入核并促进血管内皮细胞凋亡基于ECPC的结构,我们合成了多个手性小分子:3d-S,3d-R,3f-S,3f-R,3k-S,3k-R,31-S,31-R。在去除血清和生长因子条件下,我们利用20μM各化合物处理HUVECs,通过形态观察、SRB、MMP、ROS 检测和 Hoechst33258、Tunel 染色以及免疫荧光对integrin β4进行定位,我们筛选到手性的吡唑环氧烷衍生物31-S能够诱导integrinβ4入核,并能促进去血清去生长因子诱导的内皮细胞凋亡。3.2利用31-S为工具研究integrin β4入核的分子机制在HEK 293细胞中,我们分别过表达GFP标记的野生型integrin β4和将1494位点酪氨酸突变为丙氨酸突变型integrin β4,31-S处理之后,突变形式integrin β4在细胞核中的定位下降;另外,靶向膜联蛋白A7的苯并噁嗪衍生物ABO可以抑制31-S诱导的integrin β4的细胞核位移。结论1神经鞘氨醇磷酸胆碱通过诱导血管内皮细胞自噬,抑制去除血清和生长因子诱导的细胞凋亡;降低Integrin β4抑制内皮细胞凋亡,诱导自噬;PC-PLC,p53是integrin β4的下游分子。2吡唑环氧烷衍生物ECPC通过integrin β4促进去血清和生长因子诱导的血管内皮细胞凋亡。3血管内皮细胞中,在去除血清和生长因子条件下,吡唑环氧烷衍生物ECPC通过FGFR1促进integrin β4 1494位点酪氨酸的磷酸化,诱导integrinβ4细胞核位移,integrinβ4发生细胞核位移之后上调与凋亡和炎症相关基因ATF3,、PTGS2、KITLG和IL-8的表达,诱导细胞发生凋亡;FGF-2抑制integrin β4 1494位点酪氨酸的磷酸化和其细胞核位移,从而抑制ATF3,PTGS2,KITLG,IL-8的表达以及细胞凋亡。4手性吡唑环氧烷衍生物31-S促进integrinβ4入核,integrinβ4入核需要其1494位点的酪氨酸磷酸化;靶向膜联蛋白A7的化学小分子ABO能抑制integrin β4入核。