论文部分内容阅读
目的：1.建立从人足月胎盘中大量分离纯化滋养细胞的实验方法；2.分离纯化乙肝携带产妇胎盘滋养细胞,观察HBV抗原和DNA在滋养细胞中的表达,了解乙肝携带产妇胎盘滋养细胞中是否存在HBV的复制；3.以HBV重组质粒转染滋养细胞来源细胞株,构建HBV感染滋养细胞的体外模型,以肝癌细胞作为对照,观察模型中HBV相关核酸和蛋白质的表达水平；4.设计构建针对HBV SmRNA的shRNA (short hairpin RNA)表达载体,与HBV重组质粒共转染滋养细胞,观察不同shRNA质粒的基因敲减效果,筛选出具有显著干扰作用的siRNA序列。方法：1.收集20例正常足月妊娠胎盘,剪取50g绒毛组织,胰酶联合DNase I消化组织,简化的密度梯度离心法联合反复贴壁法分离纯化滋养细胞,细胞免疫荧光标记法、激光扫描共聚焦显微镜技术(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)检测滋养细胞内CK-7蛋白的表达,计算滋养细胞纯度。2.收集9例血清HBsAg. HBeAg双阳性产妇胎盘,分离纯化滋养细胞,细胞免疫荧光标记法、LSCM技术检测滋养细胞纯度；微粒子酶免分析法(Microparticle enzyme immunoassay, MEIA)、荧光定量PCR (Fluorescencequantitative PCR, FQ-PCR)检测体外培养24、48、72h滋养细胞培养上清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达量,确定滋养细胞是否感染HBV; FQ-PCR检测感染HBV滋养细胞中是否表达HBV复制的指标共价闭合坏DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)3.通过脂质体介导法,以HBV重组质粒pcDNA3-3HBV转染滋养细胞来源细胞株JEG-3、JAR和肝癌细胞HepG2; PCR检测胞内HBV两种DNA分子形态rcDNA (relaxed circular DNA)和cccDNA的表达,FQ-PCR检测培养上清HBV DNA的滴度；RT-PCR (reverse transcription PCR)检测HBsAg编码mRNA的表达：细胞免疫荧光标记法、结合LSCM技术检测细胞内HBsAg和HBcAg的表达；MEIA检测培养上清HBsAg、HBeAg的分泌量,从DNA、RNA、蛋白质三个层面对细胞模型进行观察。G418筛选培养基对转染后JAR和JEG-3细胞进行筛选。4.设计构建4种针对HBV SmRNA的shRNA表达载体,分别命名为pS-603、pS-475、pS-66、pS294,设置错义链载体pS-scramble和空白载体pS-0为干扰特异性对照和空白对照。脂质体介导法与HBV重组质粒共转染JAR细胞,转染后48、72、96h收集细胞及培养上清。细胞免疫荧光标记结合LSCM技术、Western blotting定量检测胞内HBsAg的表达；MEIA定量检测培养上清HBsAg的分泌量；实时荧光定量逆转录PCR (Fluorescence quantitative reverse transcription PCR, FQ-RT-PCR)检测胞内SmRNA表达量；FQ-PCR检测培养上清HBV DNA滴度,分析比较不同shRNA的干扰效果。结果：1.经胰酶、DNase I联合消化胎盘组织,简化的密度梯度离心法联合反复贴壁法,每50 g胎盘组织可获得约108、纯度约85%,活力约88%的滋养细胞。2.9例乙肝携带产妇胎盘滋养细胞体外培养24、48、72h,培养上清的HBsAg表达量(S/N值)分别为3.72±1.41、1.99±0.87和1.75±0.99,HBeAg的表达量(S/CO值)分别为2.26±1.31、0.62±0.36和0.49±0.40,提示9例血清HBsAg、HBeAg双阳性产妇胎盘组织皆感染了HBV；其中,HBsAg和HBeAg 24h表达量皆高于48h、72h(p<0.05)。上清HBV DNA的滴度分别为(2.39±1.87)×103 copies/mL、(1.04±0.94)×103 copies/mL和(0.78±0.68)×103 copies/mL,3个时间点之间无明显差异。9例乙肝胎盘滋养细胞样本中2例样本检测到少量HBV cccDNA的表达,分别为6.75×103 copies/mL、2.22×103 copies/mL。3.转染pcDNA3-3HBV的JEG-3、JAR、HepG2细胞胞内表达rcDNA、cccDNA和SmRNA.培养上清可检测到HBV DNA的表达,JEG-3与JAR细胞上清HBV DNA的表达量无显著性差异,HepG2培养上清HBV DNA滴度明显高于2种绒癌细胞的表达(p<0.05)转染细胞内表达HBsAg和HBcAg;培养上清HBsAg和HBeAg的表达量比较,JEG-3与JAR细胞无显著性差异,HepG2细胞则明显高于2种绒癌细胞(p<0.05)。经G418筛选,转化的JAR细胞形成持续生长的阳性克隆系,而JEG-3在筛选过程中逐渐死亡4. shRNA与HBV重组质粒共转染JAR细胞后,pS-603、pS-475、pS-66组细胞内、培养上清HBsAg,胞内SmRNA和培养上清HBV DNA的表达量,随转染后时间推移逐渐降低(P<0.05)pS-294、pS-scramble和pS-0组细胞HBsAg编码mRNA和蛋白质的表达、培养上清HBV DNA的滴度无显著性差别,并且不随时间推移而改变。结论：1.简化的密度梯度离心法联合反复贴壁法,可获得大量纯化的足月胎盘滋养细胞。2.HBV感染的胎盘中可能存在低水平的HBV复制,但滋养细胞中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达可能不是HBV持续复制的结果。3.HBV重组质粒构建的HBV感染滋养细胞体外模型中,存在HBV的复制和病毒蛋白的表达。4.RNA干扰可抑制HBV感染滋养细胞体外模型中病毒蛋白的表达。4种shRN表达质粒中,pS-603、pS-475、pS-66干扰效果明显,而pS-294干扰效果不明显。