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目的:通过制作大鼠背部创伤模型,在大鼠模型的饮食中加入适量的L-精氨酸(L-arginine L-Arg),并在伤口局部联合应用纤维连接蛋白(Fibronectin FN),干预创面的愈合过程,观察L-精氨酸与纤维连接蛋白联合应用对创面愈合速度和愈合质量的影响;并通过免疫组织化方法揭示创伤过程中一氧化氮合酶的表达规律;通过光镜观察愈合期间不同阶段的成纤维细胞数量及胶原纤维含量;通过组织化学方法检测肉芽组织中羟脯氨酸含量;通过实验前后的对比,计算创面的愈合率。研究L-精氨酸与纤维连接蛋白联合应用对促进伤口愈合的影响,为临床探索一条促进创面愈合的有效方法,并为进一步深化创面愈合修复的临床研究提供客观的实验依据。
方法:
1、实验动物:雄性健康Wistar大鼠48只,称重,编号。
2、实验分组:将大鼠随机分为4组:即对照组(0.9%生理盐水)、实验A组(L-精氨酸500mg/kg/d联合0.5mg/ml的FNO.05ml.)、实验B组(0.5mg/ml的FNO.05ml)、实验C组(L-精氨酸500mg/kg/d)。每组12只。
3、创面模型制备方法:大鼠背部剪毛,10%硫化钠脱毛,温水清洗,拭干。次日,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(30 mg/kg)成功后,将大鼠固定在手术台上。在背部脊柱两侧旁开1cm,头尾两端平行于脊柱各标记一个直径1.8 cm,面积2.54 cm<2>的圆形切口线。经碘伏消毒皮肤后,用剪刀沿标记线剪除全层皮肤至深筋膜,形成4个圆形创面。取0.5mg/ml纤维连接蛋白溶液注射于实验A组及B组创面筋膜层及创缘皮下组织内,每个创面0.05 ml,对照组和实验组均给予0.9%生理盐水敷料包扎。待大鼠清醒后,按照500mg/kg/d计算分别给予实验A组及C组L-精氨酸灌胃。每日换药一次(动物处死当天不换药)。实验A组及B组每天每个创面注射0.05 ml/d的FN,直至处死动物。
4、取材:每组动物分为4组,每幺且3只,分别在术后3、7、10、14天切取原创伤范围内组织,随机将一块组织固定在4%多聚甲醛中,常规石蜡包埋切片,分别行常规HE染色、VG染色及免疫组化染色。剩余的组织于-20℃冷冻保存,行组织化学检测。
5、观察指标: (1)大体观察。 (2)成纤维细胞密度(numerical density on area,NA):400倍光镜下观察HE染色切片,在肉芽组织中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取10个矩形视野(0.0052mm<2>/视野),目测计数并计算切片内单位面积成纤维细胞数量,结果取均数。(3)胶原纤维面密度(area density on area,AA):VG染色组织切片,在肉芽组织中央浅部、中央深、两侧部各随机选取5个视野,利用计算机辅助病理图像分析系统,计算红染的胶原纤维的面密度,结果取均数。 (4)按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书操作测定肉芽组织羟脯氨酸含量。 (5)对免疫组化染色切片,光镜观察NOS2分布部位和着色深浅程度。采用数码医学图像分析系统,测阳性细胞比率。 (6)术后观察创面愈合情况,并按公式计算创面愈合率愈合率=(原始创面面积一未愈合创面面积)/原始创面面积。
6、统计学处理:用SPSS12.0 for windows统计软件,采用单因素方差分析方法进行统计学处理,数据以X±S表示,P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1、形态学观察:对照组于创伤后14天可以完全愈合:实验A组肉芽组织生长良好,且愈合时间较对照组提前3-4天,实验B组、C组愈合情况良好,较对照组提前1-2天。
2、光镜观察:实验A组在创伤后3天比对照组和实验B、C组均有较多的的毛细血管生成,创伤后14天成纤维细胞排列整齐;实验B、C组于创伤后3天也有较多的毛细血管生成,但较实验A组少,且炎性反应亦较实验A组严重。
3、成纤维细胞密度(NA):实验A、B、C组在创伤后3、7天NA均高于对照组水平(P<0.05),而在创伤后10、14天均低于对照组(P<0.05):而实验A组较B、C组更为明显P<0.01)。
4、胶原纤维面密度(AA):四组均呈持续性增加的趋势,实验A组在所有时间点均高于对照组(P<0.01):B组、C组在所有时间点亦高于对照组(P<0.05)。
5、羟脯氨酸含量:对照组羟脯氨酸含量从创伤后第3天到第14天进行性增加:实验A组在创伤后各时间点羟脯氨酸含量均高于对照组(P<0.01);实验B组和C组在各时间点的的羟脯氨酸含量亦高于对照组(P<0.05)。
6、NOS2阳性细胞比率:对照组伤后3天细胞阳性染色强度增强并达到高峰,3-7天细胞中的NOS2在细胞中的阳性表达相对维持稳定水平,伤后10天细胞中的阳性表达再次达到一个高峰,其后阳性表达逐渐减弱。而实验A、B、C三组创伤后3天开始细胞阳性染色增强,到第10天时达到高峰,其中以A组阳性表达最强(A组P<0.01,B、C组P<0.05),其后阳性表达逐渐减弱。
7、创面愈合率:实验A、B、C三组于3天后创面愈合较对照组明显加快,其中A组较B、C组显著加快(A组P<0.01,B、C组P<0.05)。
结论:在创面的愈合过程中单独使用L-精氨酸或纤维连接蛋白可以促进创面的愈合,而局部外用纤维连接蛋白同时应用L-精氨酸则具有显著的促进创面修复的作用,可以明显加快大鼠创面的愈合时间。