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研究背景目前，由致病微生物引起的感染性疾病仍然属于危害人类生命的主要杀手。宿主抗感染免疫应答是决定感染性疾病发展和转归的关键因素。获得性免疫应答是宿主抵抗致病微生物再次感染的关键，也是疫苗发挥作用的基础。CD4+T细胞应答在获得性免疫应答中发挥中枢作用：首先，其能促进B细胞分化成熟并产生抗体，辅助抗体类型的转换；其次，能促进CD8+T细胞的增殖并辅助记忆CD8+T细胞的形成；还能分泌多种细胞因子直接干扰病毒的复制，或通过招募其他免疫细胞到达感染部位间接对病原体进行清除，甚至可以像CD8+T细胞那样介导对病毒感染靶细胞的直接杀伤。CD4+T细胞应答具有抗原特异性、HLA限制性和免疫优势应答等特性。CD4+T细胞应答的抗原特异性是指其只能识别由13-20个氨基酸组成的表位，而不是整个抗原或整个病原体，使得同一病原体或蛋白抗原诱导的CD4+T细胞应答在表位水平具有不同的特异性。CD4+T细胞应答的HLA限制性是指：不同HLA分子通过递呈不同的表位而诱导产生不同的表位特异性CD4+T细胞应答，使得不同个体之间因HLA分子的差异产生不同表位特异性应答。免疫优势应答即，在针对复杂病原体时，由于HLA的共显性特征，同一个体中的不同HLA分子能同时递呈多个抗原表位诱导产生不同表位特异性应答，各应答之间相互抑制，产生强弱差异，使得主要的应答仅仅聚焦于少数表位，形成优势应答。优势应答能发挥更强的抗感染免疫作用，但病原体可通过突变优势应答表位逃避杀伤。因此，研究CD4+T细胞抗原特异性、HLA限制性以及免疫优势应答特征对揭示机体的抗感染免疫机制，研发有效疫苗等具有重要意义。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是定植于人胃粘膜的重要致病菌，是胃炎、胃溃疡等胃部疾病的主要致病因素，与胃癌、粘膜相关淋巴瘤的发生密切相关，目前我国每年因胃癌死亡人数高达20万人。甲型流感病毒（InfluenzaAvirus，IAV）是一种能够导致人类及动物罹患流行性感冒的RNA病毒，其每年会造成全球约50万人的死亡，且常在世界范围内周期性大流行。研究证实，CD4+T细胞应答在宿主抵抗H. pylori和IAV感染的保护性免疫应答中至关重要。但其抗原特异性、HLA限制性及免疫优势应答特征研究甚少，有待深入系统的研究。研究目的1.利用H. pylori与IAV自然感染人体外周血中的记忆细胞，建立H. pylori与IAV抗原特异性CD4+T细胞系，观察其效应分子表达情况，探讨其在抗H. pylori与IAV感染免疫中的可能作用；2.筛选鉴定H. pylori与IAV抗原特异性CD4+T细胞的优势应答抗原及表位，比对表位序列保守性，评价其在H. pylori与IAV疫苗设计中的可能应用；3.明确H. pylori与IAV不同表位特异性优势CD4+T细胞应答的HLA限制性，发掘H. pylori与IAV抗原特异性CD4+T细胞应答在含有相同或者不同HLA基因型个体中的优势应答特征及规律；4.分析H. pylori感染不同个体的优势应答频率及其与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病发生发展的相关性，揭示优势应答对H. pylori感染导致不同类型胃病发生与转归的作用和机制；研究方法1. H. pylori粘附素A亚单位（H. pylori adhesion A subunit，HpaA）抗原特异性CD4+T细胞免疫优势应答特性研究利用13C呼气试验、血清抗H. pylori抗体ELISA法及尿素酶试纸法筛选H. pylori感染者；利用重组HpaA蛋白体外刺激H. pylori感染者PBMC扩增建立HpaA特异性CD4+T细胞系；通过ICS技术对HpaA特异性CD4+T细胞效应分子表达谱进行检测；利用步移重叠合成肽对优势抗原表位进行筛选鉴定；利用PCR-SBT法对HLA进行基因分型；利用抗体阻断和BLCL表位递呈实验对表位HLA限制性进行鉴定；通过体外诱导单核细胞来源的树突状细胞及BLCL对表位的自然加工递呈特征进行鉴定；通过MACS技术及ELISPOT技术对优势表位特异性CD4+T细胞的记忆表型及离体频率进行检测；通过比较多个HLA-DRB1*1501阳性个体的优势应答谱系对优势应答规律进行分析；通过分析H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病个体之间优势CD4+T细胞应答频率的差异，揭示优势应答对H. pylori感染导致不同类型胃病发生与转归的作用和机制。2. IAV抗原特异性CD4+T细胞免疫优势应答特性研究利用IAV感染P815细胞裂解物全抗原体外刺激扩增建立IAV特异性CD4+T细胞系；通过重组痘病毒感染P815细胞裂解物制作的IAV单个抗原对免疫优势蛋白抗原进行筛选；利用步移重叠合成肽对优势抗原表位进行鉴定；利用PCR-SBT基因分型、抗体阻断和BLCL表位递呈实验对表位HLA限制性进行鉴定；利用ICS技术对IAV表位特异性CD4+T细胞效应分子表达谱进行检测；利用多序列比对对表位序列保守性进行评价。主要结果1. HpaA抗原特异性CD4+T细胞免疫优势应答特性研究1.1成功创立HpaA特异性CD4+T细胞系培养方法。该方法能从H. pylori感染阳性者PBMC特异性扩增出HpaA特异性CD4+T细胞系，而H. pylori感染阴性者PBMC不能扩增出HpaA特异性CD4+T细胞系。1.2研究发现HpaA特异性CD4+T细胞系主要分泌IFN-γ，不分泌IL-4、IL-10和IL-17A，属于Th1型CD4+T细胞应答。1.3首次筛选鉴定出HpaA192-204，HpaA88-100和HpaA200-212三个H. pylori抗原的功能性免疫优势CD4+T细胞表位。1.4研究确定了HpaA192-204、HpaA88-100和HpaA200-212三个免疫优势表位特异性CD4+T细胞应答的HLA限制性分别是DRB1*0406、DRB1*1501和DQB1*0301。1.5研究证实了上述优势表位特异性CD4+T细胞具有记忆表型，且体外扩增过程不会改变免疫优势应答谱系。1.6研究证实了上述优势表位均能够被抗原递呈细胞自然加工递呈，且部分表位氨基酸序列在H. pylori不同菌株之间高度保守，可作为H. pylori表位疫苗的候选抗原。1.7从1115例胃部疾病患者筛选出59例HLA-DRB1*1501阳性的H. pylori感染患者，研究发现HpaA88-100特异性CD4+T细胞应答在携带HLA-DRB1*1501基因的H. pylori感染阳性个体中处于免疫优势地位。1.8首次证实HLA-DRB1*1501介导的HpaA88-100特异性CD4+T细胞应答频率与H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等胃部疾病的严重程度呈负相关关系，提示HLA-DRB1*1501对胃部疾病的保护作用是通过介导优势CD4+T细胞应答来实现的，也表明HpaA88-100为H. pylori特异的保护性表位。2. IAV抗原特异性CD4+T细胞免疫优势应答特性研究2.1成功制备出可溶性IAV感染P815细胞全抗原，并以此成功创立IAV全抗原特异性CD4+T细胞系培养方法。2.2研究发现IAV全抗原特异性CD4+T细胞系主要分泌分泌IFN-γ和TNF-α，不分泌IL-2，但上调表达CD107分子。表明IAV抗原特异性CD4+T细胞主要通过IFN-γ和TNF-α直接干扰病毒复制和直接的细胞毒性作用介导抗病毒保护性免疫。2.3成功制备出可溶性IAV单个抗原，研究证实了M1与NP是IAV特异性CD4+T细胞应答的优势抗原靶标。2.4筛选鉴定出M1129-141、M1209-221、NP404-416和NP463-475等四个免疫优势IAV特异性CD4+T细胞表位以及M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和NP115-127等六个亚优势IAV特异性CD4+T细胞表位。2.5研究明确了M1129-141、M1209-221、NP404-416和NP463-475四个免疫优势IAV特异性CD4+T细胞应答的HLA限制性分别是DRB1*0101、DPB1*0301、DRB1*0404和DRB1*0901；M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和NP115-127等六个亚优势IAV特异性CD4+T细胞应答的HLA限制性分别是DRB1*0701、DRB1*1302、DRB1*0404、DRB1*0901、DPB1*0101和DPB1*0601。2.6研究发现在新流行的IAV菌株中存在着大量表位突变体，且免疫优势表位的突变频率大于亚优势表位，表明优势表位比亚优势表位面临着更大的选择压力。研究意义1.本课题创立了利用H. pylori自然感染个体PBMC体外扩增培养建立HpaA抗原特异性CD4+T细胞系的方法。筛选鉴定了H. pylori第一个HLA限制的并具有免疫原性的CD4+T细胞表位。首次对H. pylori保护性抗原HpaA特异性CD4+T细胞应答的免疫优势特性进行了系统性分析。并证实HLA-DRB1*1501介导的HpaA88-100特异性优势CD4+T细胞应答对H. pylori所致慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病具有保护性作用。为H. pylori保护性抗原免疫优势表位的筛选鉴定提供了新的方法，为深入理解抗原特异性CD4+T细胞应答在H. pylori感染免疫中的优势应答特性及其对H.pylori感染导致不同类型胃病发生与转归的作用和机制提供新的认识，也为H. pylori新型疫苗设计提供了新的候选抗原。2.本课题利用IAV感染P815细胞制作的可溶性IAV全抗原创立了IAV多克隆抗原特异性CD4+T细胞系的培养方法。首次从IAV全基因组蛋白水平明确了IAV抗原特异性CD4+T细胞应答所聚焦的优势抗原靶标是M1与NP。筛选鉴定了若干M1与NP来源的新的免疫优势及亚优势CD4+T细胞表位。系统分析比较了优势表位与亚优势表位的序列保守性，证明优势表位面临更强的选择压力。为深入理解抗原特异性CD4+T细胞应答在IAV感染免疫中的优势应答特性及其保护作用机制提供了新的认识，为基于T细胞应答的IAV新型疫苗设计的抗原选择提供了参考依据。