论文部分内容阅读
【目的】苹果是我国最重要的经济果树之一,面积和产量均居世界首位。土壤盐碱化严重威胁我国西北地区苹果产业的可持续发展,在我国出台耕地保护政策的背景下,显得更加迫切。作为多年生果树,通过嫁接耐盐碱抗性砧木,可有效提高苹果的盐碱耐受能力,扩大苹果栽培区域,实现“上山上坡、利用四荒”。然而对苹果砧木盐碱抗性的研究多集中于中性盐或碱性盐胁迫响应的生理和分子机制研究,复合盐碱胁迫对苹果砧木生长发育及相关生理分子机制的解析尚不清晰。WRKY转录因子在植物的生长发育以及胁迫响应中发挥着重要作用,但苹果中WRKY响应盐碱胁迫的功能研究还很有限。因此,在盐碱胁迫条件下,明确不同苹果抗性砧木地上及地下形态、生理和分子相关盐碱胁迫响应机制以及WRKY在此响应过程中的功能,对揭示苹果砧木盐碱响应机制及耐盐碱砧木选育具有重要的理论和实践意义。【方法】（1）以不同盐碱耐受性苹果砧木‘珠美海棠’、‘圆叶海棠’、‘青砧1号’、‘M.9-T337’、‘SH.6’、‘B.9’、‘M.26’和‘Mark 9’组培苗为试材,在水培体系下使用75 m M（Na Cl+Na HCO3,摩尔比1:1）复合盐碱处理,对以上8种砧木的形态、生理及基因表达特征进行了系统比较;并结合相关性、主成分和聚类分析,评价8种砧木的相对盐碱耐受性。（2）以‘青砧1号’为试材,测定和分析其在盐碱胁迫0 h、1 h、6 h、12 h和24 h时的相关形态、生理和基因表达特性,筛选差异及关键基因。（3）以‘珠美海棠’、‘青砧1号’、‘M.9-T337’、‘SH.6’和‘B.9’苹果砧木根系材料为模板,克隆MdWRKY75d;使用MEGA和DNAMAN对MdWRKY75d进行序列分析;利用q RTPCR对MdWRKY75d进行表达模式分析;运用农杆菌介导的转基因方法,瞬时转化烟草叶片以明确MdWRKY75d的亚细胞定位,稳定转化拟南芥和苹果愈伤,以分析MdWRKY75d在盐碱胁迫和脱落酸（ABA）响应中的功能。（4）利用DAP-seq及酵母单杂交技术,筛选并验证MdWRKY75d的部分靶基因,利用转基因拟南芥分析了靶基因MdSAUR15的功能。【结果】本研究的主要结果如下:（1）明确了8种苹果砧木对盐碱胁迫的相对耐受性。通过系统比较8种苹果砧木的形态、生理和基因表达对盐碱胁迫的响应特性,基于盐碱胁迫指数的聚类分析,将其分为3类:盐碱高耐受型:‘珠美海棠’和‘青砧1号’;盐碱耐受型:‘圆叶海棠’、‘M9-T337’、‘SH.6’;盐碱敏感型:‘B.9’、‘M.26’和‘Mark 9’。（2）解析了‘青砧1号’响应盐碱胁迫的相关生理和分子机制。结果表明:‘青砧1号’通过提高过氧化物酶（POD）和ABA含量,缓解盐碱胁迫造成的根系活力和光合能力下降及氧化伤害。进一步构建了‘青砧1号’根系响应盐碱胁迫的RNA-seq数据库,并对离子转运、活性氧清除、植物激素通路和转录因子相关差异基因的表达特征进行了分析,结果表明:盐碱胁迫显著上调了‘青砧1号’根系中大多数质子泵、K+吸收、抗氧化酶以及ABA和乙烯（Eth）相关差异基因的表达水平;下调了Na+/H+逆向转运体、生长素（IAA）、油菜素内脂（BR）和茉莉酸（JA）相关基因表达水平。转录因子差异相关基因主要集中在WRKY、NAC、MYB、HSF和ERF家族,结合响应特征和功能注释等分析,筛选到关键基因MdWRKY75d。（3）分析了MdWRKY75d在盐碱胁迫和外源ABA响应中的功能。结果表明:苹果MdWRKY75d的氨基酸序列在不同苹果砧木中高度保守,在进化上与Pb WRKY75的亲缘关系最近,蛋白定位于细胞核,不具有转录激活活性。MdWRKY75d可受盐碱胁迫和外源ABA处理显著诱导,其表达水平与砧木的盐碱耐受性呈负相关。MdWRKY75d异源过表达提高了转基因拟南芥对盐碱胁迫和ABA的敏感性。过表达MdWRKY75促进了苹果愈伤在盐碱和外源ABA处理下的生长;干扰表达MdWRKY75d抑制了苹果愈伤在盐碱和外源ABA处理下的生长。（4）筛选并验证了MdWRKY75d的部分靶基因,明确了MdWRKY75d对MdSAUR15的转录抑制作用,并分析了MdSAUR15的功能。构建了MdWRKY75d下游靶基因数据库。利用DAP-seq及酵母单杂交证实了MdWRKY75d可以直接结合MdAKTI、MdSAUR15和MdERF2的启动子。进一步以MdWRKY75d苹果转基因愈伤为背景,发现MdWRKY75d可以抑制MdSAUR15表达水平。苹果MdSAUR15的蛋白序列在蔷薇科植物中高度保守,在进化上与Mb SAUR15的亲缘关系最近,蛋白定位于细胞核和细胞膜。过表达MdSAUR15可以促进拟南芥的根系发育,并提高转基因拟南芥的盐碱耐受性。【结论】本研究中8种苹果砧木的盐碱耐受性存在差异,‘青砧1号’盐碱耐受性优于其他砧木,可作为苹果耐盐碱候选砧木及苹果砧木盐碱胁迫响应机理研究的理想材料。‘青砧1号’通过上调质子泵、K+吸收、抗氧化酶和ABA及Eth相关基因的表达,参与离子平衡、活性氧清除和内源激素调节响应盐碱胁迫。在10 m M（Na Cl+Na HCO3）盐碱胁迫和10μM外源ABA处理下,过表达MdWRKY75d基因可以促进苹果愈伤的生长。过表达苹果MdSAUR15基因可以促进转基因拟南芥根系的发育和提高盐碱耐受性,MdSAUR15可作为苹果砧木抗性遗传改良的候选基因。