水稻脂肪氧化酶3(LOX3)互作蛋白的筛选及蛋白组学分析结果验证

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shiweifeng15
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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,其在保存的过程中容易发生霉变、陈化变质等问题,造成大量的粮食损失。水稻耐储性问题也成为育种家所面临的主要挑战之一。前期研究基础表明,脂肪氧化酶3(LOX3)是水稻种子脂肪氧化过程中的关键酶,LOX3的缺失、反义和干扰表达可提高水稻种子的耐储藏性,但其具体作用机理尚不清楚。本研究利用实验室前期构建的差异蛋白表达谱,剖析LOX3代谢途径,明确LOX3如何与上、下游基因协调作用,影响稻谷的耐储性;同时利用酵母双杂交系统筛选LOX3的互作蛋白,结合GST pull-down技术对筛选的互作蛋白进行验证,进而明确水稻种胚LOX3代谢途径以及LOX3参与调控稻谷耐储性的分子机理。主要研究结果如下:1.构建了 pGBKT7-LOX3的酵母双杂交诱饵载体,自激活实验结果表明pGBKT7-LOX3不存在自激活现象,将诱饵载体与cDNA文库杂交,通过四缺培养基筛选得到互作蛋白,构建pGADT7载体进行共转复筛,最终筛选出了 2个与LOX3可能互作的蛋白质,对应基因分别为:Os02g0758000和Os09g0438700。2.构建了带有pMAL标签pMAL-c5X-LOX3原核表达载体,带有GST 标签的 pGEX-6P-1-Os0990g38700和pGEX-6P-1-Os02g0758000原核表达载体,转化BL21菌株,经诱导后获得经SDS-PAGE分析,得到 pMAL-LOX3,GST-Os09g0438700和GST-Os09gg0758000融合蛋白。3.通过对种胚LOX3相关代谢通路分析,选择6个在转反义LOX3基因水稻种子老化前、后差异显著蛋白,其对应的基因分别为:Os01g0348600,Os11g0605500,Os06g0204400,Os02g0116500,Os09g0570300,Os02g0676000。通过qRT-PCR技术分析在老化处理前后这些基因表达量的变化情况。结果发现,6个基因在转基因种子与对照种子老化处理前后的表达量变化差异显著,与前期蛋白质组学结果一致。
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