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目的:利用SELEX技术筛选靶向巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子,并初步鉴定其与巨噬细胞源性泡沫细胞及动脉粥样硬化病变结合的特异性。 方法:体外培养的THP-1细胞,经100nmol/L PMA孵育72小时,诱导其分化成巨噬细胞,然后用80mg/L氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)孵育72小时,建立泡沫细胞模型,通过油红O染色观察细胞内脂滴,HPLC检测细胞内胆固醇含量。体外合成一个含35个核苷酸随机序列、总长81nt、库容量大约为1015-16的ssDNA文库;优化了ssDNA库PCR反应条件,用生物素和FITC标记的引物扩增为dsDNA文库并以生物素-链霉亲和素磁珠分离方法构建FITC标记的ssDNA文库;以六孔板为筛选介质,ssDNA文库先分别与大鼠血管平滑肌细胞和THP-1巨噬细胞结合,反筛除去与其结合的ssDNA,然后与巨噬细胞源性泡沫细胞结合,洗脱与其结合的ssDNA,PCR扩增构建次级FITC标记的ssDNA文库进行下一次筛选。利用荧光显微镜观察每轮FITC标记的ssDNA文库与大鼠血管平滑肌细胞、THP-1巨噬细胞和巨噬细胞源性泡沫细胞结合的情况。将最后一轮筛选后得到的ssDNA用无标记的引物PCR扩增,转入JM109大肠杆菌中克隆和测序。应用DNA MAN软件和RNA structer4.2软件对每一个适配子的保守序列和二级结构进行分析,筛选出文库中富集程度最高、结构特点最明显的适配子进行体外合成,FITC标记后,利用荧光显微观察及PCR方法鉴定其与巨噬细胞源性泡沫细胞及动脉粥样硬化病变结合的特异性。 结果:1、THP-1细胞经oxLDL处理后,油红O染色观察到细胞内脂滴明显增多,HPLC检测发现细胞内的胆固醇含量显著增加,由6.5±3.8 ug/mg升至103.7±3.6ug/mg,胆固醇脂/总胆固醇大于50％,说明泡沫细胞模型建立成功。 2、通过条件优化,确立以退火温度72℃为基础的ssDNA文库PCR反应条件,用FITC、Biotin标记的引物可扩增为dsDNA。标记有FITC和Biotin的dsDNA经链亲和素磁珠结合、0.15mol/L的NaOH变性后,可制备出产物量大,纯度高,符合SELEX筛选要求的FITC标记ssDNA文库。 3、SELEX筛选过程中,随着筛选轮数的增加,文库中寡核苷酸与泡沫细胞结合的特异性逐渐增强。经过18轮筛选,与泡沫细胞结合的ssDNA得到了富集和进化,而随机文库中的ssDNA几乎不再与平滑肌细胞、THP-1巨噬细胞结合。 4、将第18轮筛选后得到的ssDNA PCR扩增后克隆测序,发现所有的适配子的一级结构没有共同的同源序列,但可以分为12个家族:家族1含有保守序列CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT,家族2含有保守序列 TGGTG,家族3两条序列完全一致,家族4含有保守序列CGTGG,家族5含有保守序列TTGTG,家族6含有保守序列GGCCC,家族7含有保守序列GGGTG,家族8含有保守序列TGTGTGG,家族9含有保守序列TTGGC,家族10含有保守序列TCTGCT,家族11含有保守序列CCACGG,家族12共5个无保守序列。二级结构预测分析表明,适配子主要形成茎环或发夹结构,这些结构特征可能是适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的结构基础。 5、通过对适配子一级结构和二级结构分析,筛选出文库中富集程度最高、结构特点最明显23号和40号适配子并进行FITC标记。通过荧光显微观察发现23号和40号适配子能特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞,而不与血管平滑肌细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞结合;通过PCR方法初步证实23号和40号适配子能特异性与兔的动脉粥样硬化病变结合。 结论:本研究建立了以泡沫细胞为复合靶的SELEX筛选的技术平台,获得的寡核苷酸适配子可以特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞及动脉粥样硬化病变,为进一步开发动脉粥样硬化的新型诊断技术和治疗药物奠定了基础。