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目的:通过腺病毒载体上调离体培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)和糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤血管组织中miR-24的表达,探讨其在糖尿病血管损伤后内膜增生中的作用及其分子机制。方法:(1)腺病毒转染及葡萄糖刺激离体培养的VSMCs:将原代VSMCs随机分为4组,分别为NG组(5 mmol/L葡萄糖干预组)、HG组(30 mmol/L葡萄糖干预组)、Ad-Scramble+HG组(空载腺病毒转染+30 mmol/L葡萄糖干预组)、Ad-miR-24+HG组(miR-24腺病毒转染+30 mmol/L葡萄糖干预组),Ad-Scramble+HG组和Ad-miR-24+HG组给予相应腺病毒转染3 d后,VSMCs再予以30 mmol/L葡萄糖刺激16 h。(2)荧光显微镜观察VSMCs中腺病毒转染效率。(3)CCK-8实验检测VSMCs增殖。(4)划痕实验及Transwell小室实验检测VSMCs迁移。(5)建立糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤模型及腺病毒体内转染:雄性SD大鼠给予高糖高脂饲料喂养4 w,继以小剂量STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,待血糖稳定2 w后行颈动脉球囊损伤,损伤节段转染相应病毒载体20 min后恢复血流。(6)荧光显微镜观察损伤血管组织中腺病毒转染效率。(7)HE染色评估损伤血管内膜增生程度。(8)免疫组化检测损伤血管组织中PCNA表达。(9)Masson染色检测损伤血管组织纤维化程度。(10)qRT-PCR检测miR-24、PIK3R1 mRNA的表达;western blot检测PI3K p85α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1、p70s6K、p-p70s6K、MMP 2、MMP 9、collagenⅠ和collagenⅢ的蛋白表达。结果:(1)腺病毒成功转染大鼠VSMCs:荧光显微镜下可见Ad-Scramble+HG组和Ad-miR-24+HG组表达明显的绿色荧光蛋白。(2)miR-24上调可抑制HG诱导的VSMCs增殖:CCK-8检测结果发现,HG促进了VSMCs增殖(P<0.05),miR-24上调抑制了HG诱导的VSMCs增殖(P<0.05)。(3)miR-24上调可抑制HG诱导的VSMCs迁移:划痕实验、Transwell小室实验及迁移相关蛋白检测结果显示,HG促进了VSMCs迁移及迁移相关蛋白表达(P<0.05),miR-24上调抑制了HG诱导的VSMCs迁移及迁移相关蛋白表达(P<0.05)。(4)miR-24上调可抑制VSMCs中胶原蛋白形成:与NG组相比,HG促进了VSMCs中胶原蛋白表达(P<0.05),miR-24上调抑制了HG诱导的胶原蛋白表达(P<0.05)。(5)miR-24上调可抑制VSMCs中PIK3R1 mRNA表达:HG刺激16 h后,VSMCs中miR-24表达明显下降(P<0.05),PIK3R1 mRNA表达明显升高(P<0.05);转染Ad-miR-24后,miR-24表达明显升高(P<0.05),PIK3R1 mRNA表达明显下降(P<0.05)。(6)miR-24上调可抑制VSMCs中PI3K/Akt信号通路活化:与NG组相比,HG促进了VSMCs中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达(P<0.05),miR-24上调抑制了HG诱导的PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达(P<0.05),PI3K p85激动剂740Y-P可明显削弱miR-24的作用。(7)腺病毒成功转染至糖尿病大鼠颈总动脉:荧光显微镜下可见Ad-Scramble组和Ad-miR-24组血管壁表达明显的绿色荧光蛋白。(8)miR-24上调可抑制血管内膜增生:HE染色结果显示,与Ad-Scramble组相比,Ad-miR-24组血管内膜面积明显减少(P<0.05),内膜面积/中膜面积比明显降低(P<0.05),且迁移相关蛋白表达明显下降(P<0.05)。(9)miR-24上调可抑制血管PCNA表达:血管免疫组化结果显示,与Ad-Scramble组相比,Ad-miR-24组血管壁PCNA阳性细胞率明显降低(P<0.05)。(10)miR-24上调可抑制血管纤维化:Masson染色及western blot实验结果显示,与Ad-Scramble组相比,miR-24上调明显抑制了损伤血管的胶原蛋白形成(P<0.05)。(11)miR-24上调可抑制损伤血管处PIK3R1 mRNA表达:与正常大鼠相比,糖尿病大鼠血管组织中miR-24表达明显下降(P<0.05),PIK3R1 mRNA表达明显升高(P<0.05);与Ad-Scramble组相比,Ad-miR-24组miR-24表达明显升高,PIK3R1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。(12)miR-24上调可抑制损伤血管处PI3K/Akt信号通路的活化:western blot实验结果显示,miR-24上调明显抑制了PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达(P<0.05)。结论:miR-24上调可通过抑制PI3K/Akt信号通路活化,拮抗糖尿病血管损伤后内膜增生。