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类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜增生为主要特点的自身免疫性疾病,它会引起患者关节的剧烈疼痛、肿胀、僵硬,甚至会影响其正常活动及日常生活质量。统计数据显示,全球约有0.5-1.0%的人口患有RA,其中约三分之一的人可能在20年内致残。若不重视RA的发病并采取系列手段预防或治疗,很可能会引起RA严重恶化并造成进行性残疾和高昂的社会经济负担。现今,RA的治疗药物主要有非甾体类抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质类激素、生物制剂等。糖皮质类激素和非甾体抗炎药对缓解僵硬和疼痛有效,却不能阻滞疾病的加重;改善病情抗风湿药能有效减轻关节肿胀、疼痛、畸形,但其抑制关节破坏的能力非常有限。此外,这些药物常伴有心血管并发症、胃肠道病变和生殖疾病等不良反应,生物制剂往往费用昂贵,这限制了它们的长期使用。因此,开发一种更加安全高效、毒副作用小的抗RA药物迫在眉睫。威灵仙（Clematidis Radix et Rhizoma）来源于毛茛科铁线莲属植物威灵仙（Clematis chinensis Osbeck）、东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr.）或棉团铁线莲（Clematis hexapetala Pall.）的干燥根和根茎,是祛风除湿、疏经通络之要药。前期文献报道威灵仙具有抗RA滑膜增生的作用,但药效物质研究多局限于威灵仙总皂苷,而疏于对威灵仙药效单体化学成分的研究,导致威灵仙抗RA滑膜增生的具体药效物质尚不清晰。再者,威灵仙的传统用法为水煎入药治疗风湿痹痛,这说明其发挥抗RA滑膜增生的药效物质为水溶性成分。我们课题组前期对来源不同的20余批次威灵仙药材进行了含量测定,发现水溶性成分木兰花碱（Magnoflorine,MAG）的含量高达0.1%,是威灵仙的主要成分和重要含量测定指标。此外,现代药理研究表明MAG具有良好的抗炎、免疫调节、神经保护、抗糖尿病、保护心血管系统等作用。然而,尚未有研究系统阐释MAG的抗RA滑膜增生作用及其分子机制。因此,我们初步推测MAG可能是威灵仙发挥抗RA滑膜增生的药效物质,并从整体-组织-细胞-信号通路角度研究MAG抗RA滑膜增生作用及其分子机制,有利于解决威灵仙具体药效物质不清晰的问题。本研究建构完全弗氏佐剂（Freund’s complete adjuvant,CFA）诱导佐剂型关节炎（adjuvant-induced arthritis,AIA）Wistar大鼠RA体内模型和IL-1β诱导MH7A细胞RA体外模型。通过观察大鼠踝关节大体形态,测量并记录大鼠体重、足肿胀度、关节炎评分,结合ELISA、HE染色对MAG抗RA滑膜增生作用进行体内药效评估;利用CCK-8、划痕实验、Transwell、流式细胞仪、免疫荧光、ELISA、q RT-PCR、Western blotting、信号通路抑制剂、si RNA等技术,对威灵仙药效物质MAG的抗RA滑膜增生作用及其机制进行体内外系统研究。具体方法和结果如下:1.通过向Wistar大鼠右后爪足跖皮下部位注射0.1 mL CFA,建立体内AIA大鼠模型。将大鼠分为5组,每组8只:对照组、AIA模型组、MAG低剂量组（5 mg/kg）、MAG高剂量组（10 mg/kg）、甲氨蝶呤阳性药组（Methotrexate,MTX 1 mg/kg）。通过腹腔注射进行给药,评估MAG在体内的抗RA滑膜增生活性。结果显示,较AIA模型组比较,MAG（5 mg/kg,10 mg/kg）能剂量依赖性地改善CFA诱导的模型大鼠的踝关节、足爪肿胀和体重下降,且减轻了模型大鼠的关节炎评分。此外,ELISA结果揭示,MAG和MTX明显地降低了模型大鼠的血清促炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α水平,上调血清抗炎因子IL-10的释放。此外,踝关节组织病理切片HE染色结果也表明MAG明显缓解模型大鼠踝关节滑膜组织的浸润与侵袭。同时,MTX组也显示出了较好的抗RA滑膜增生药效。以上结果说明MAG在AIA大鼠体内发挥良好的抗RA滑膜增生作用。2.建立IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞MH7A模型,给药24h和48h后,采用CCK-8法测定不同浓度MAG（1.25,2.5,5,10,20,40μM）对MH7A细胞存活率的影响,并采用无毒性的MAG浓度用于抗MH7A细胞增殖的药效筛选,结果发现,MAG（5,10μM）处理24h和48h后明显减少IL-1β（10 ng/m L）诱导的MH7A细胞增殖,呈剂量和时间依赖性。采用q RT-PCR、ELISA、Western blotting测定炎症因子IL-6、IL-8、COX-2、i NOS的表达情况,利用DCFH-DA探针,结合流式细胞仪、荧光显微镜检测各组别中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量,对抗氧化关键信号通路Keap1-Nrf2/HO-1中的关键蛋白进行测定,检测MAG给药后Nrf2的核易位情况。结果发现MAG剂量依赖性地降低IL-1β诱导的炎症因子和ROS产生,提高核内Nrf2蛋白、HO-1的表达,降低Keap1的表达量及细胞质Nrf2蛋白的表达,并促进细胞质的Nrf2向细胞核迁移,这说明MAG发挥减少炎症因子、ROS产生的作用与激活Keap1-Nrf2/HO-1信号通路有关。采用siRNA技术敲低Nrf2基因的表达,转染MH7A细胞,并利用qRT-PCR、Western blotting测定转染效率,检测Nrf2基因、蛋白的表达情况。采用荧光显微镜、流式、划痕实验、Transwell、q RT-PCR、Western blotting,检测IL-1β处理后MAG对MH7A细胞ROS含量、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响,并测定基质金属蛋白酶（MMPs）和凋亡基因、蛋白的的表达情况。结果表明,MAG能明显降低IL-1β诱导的MH7A细胞ROS产生,抑制MH7A细胞迁移、侵袭,减少MMPs产生,促进MH7A细胞凋亡,并调节MH7A细胞周期,且Nrf2因子在上述MAG发挥的抗RA滑膜增生药效中发挥重要调控作用。NF-κB和PI3K/Akt信号通路影响滑膜成纤维细胞的生长、迁移、侵袭、分化、炎症反应等生命过程,基于此,利用Western blotting测定NF-κB、PI3K/Akt信号通路中关键蛋白的表达情况,进一步运用NF-κB、PI3K/Akt抑制剂BAY11-7082、LY294002证明MAG是潜在的NF-κB、PI3K/Akt通路抑制剂,且调控PI3K/Akt、NF-κB和Keap1-Nrf2/HO-1、NF-κB信号通路之间的串话。以上结果证明MAG发挥抗炎、促凋亡、抗氧化的作用与PI3K/Akt、NF-κB、Keap1-Nrf2/HO-1信号通路的调节以及通路之间的串话有关,且Nrf2基因对于MAG发挥抗RA滑膜增生作用至关重要。