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近年来,由Barrett食管(Barrett′s esophagus,BE)转化而来的食管腺癌的发病率明显升高,成为所有恶性肿瘤中增长速度最快的一种。食管腺癌是一种恶性度较高的消化道肿瘤,其侵袭力和转移率较高,许多患者在就诊时已处于肿瘤晚期,5年生存率很低。目前与食管腺癌侵袭转移有关的因子成为当前研究重点之一。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)通过其细胞表面的受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)即表皮生长因子受体介导发挥多种生物学效应。有研究表明:EGF与受体结合后,通过激发多条信号传导通路,将有丝分裂信号传递到细胞核,引起细胞增殖,同时在细胞的侵袭、转移中起重要作用。另有研究发现EGF及其受体EGFR在食管腺癌组织中表达明显增高,并与肿瘤的发展和预后密切相关。提示EGF可能在刺激食管腺管癌细胞侵袭,促进肿瘤发展过程中发挥重要作用。肿瘤侵袭是一个多阶段过程,包括细胞增殖、黏附、运动及各种酶的分泌。在这些环节中,细胞外基质和细胞基底膜的降解是肿瘤侵袭过程中的关键所在。研究证实,尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, u-PA)作用系统被认为在细胞外基质和基底膜的降解、促进肿瘤侵袭转移过程中起核心作用。其他多种恶性肿瘤(包括肺癌、胰腺癌、胃癌、直结肠癌、前列腺癌等)研究中发现u-PA的激活与肿瘤侵袭力有关。现已证实体内多种因子如TGF、IGF、EGF、KGF、IL-1等均能调控u-PA表达,但迄今为止对其表达的分子调控机制研究较少。EGF与其受体结合后诱导MAPK的磷酸化级联反应,是EGF诱导的重要反应。p38是MAPK家族中的一员,是一组细胞内信号转导分子,p38MAPK上游的MAPKK通过磷酸化p38MAPK的Thr-Gly-Tyr位点中的苏氨酸和酪氨酸使其活化,活化的p38MAPK进一步调控下游多种基因的表达,参与调控炎症、细胞生长、细胞分化,细胞周期及细胞死亡、侵袭表型等。近年来研究发现,p38MAPK信号转导通路参与胃癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等细胞u-PA的表达调控。目前尚未见关于p38MAPK信号转导通路与食管腺癌SEG-1细胞侵袭关系的相关报道。为此,本研究从EGF着手,通过对p38MAPK信号转导通路的特异性阻断,观察阻断前后p38MAPK蛋白、u-PA表达变化,研究p38MAPK信号转导通路在EGF诱导SEG-1细胞表达u-PA中的作用,探讨食管腺癌细胞侵袭机制。目的:探讨EGF通过p38MAPK信号转导通路诱导SEG-1细胞表达u-PA促进肿瘤侵袭的机制。方法:采用体外细胞培养技术培养食管腺癌SEG-1细胞,以相同浓度的EGF (100ng/ml)按时间梯度刺激SEG-1细胞,应用Western blot法测定各时间点总p38MAPK蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、u-PA蛋白表达,应用RT-PCR方法检测各时间点u-PA mRNA表达。用p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理细胞后,观察上述指标变化。结果:①EGF对SEG-1细胞p38MAPK蛋白表达的影响:应用Western blot方法检测p38MAPK蛋白表达,结果显示大约在43KD位置出现p-p38MAPK特异性条带,在38KD位置出现t-p38MAPK特异性条带。EGF作用于SEG-1细胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高,磷酸化程度随EGF作用时间的变化而变化:1h,6h,12h,24h,48h的p38MAPK磷酸化的百分比分别为11.2%,26.4%,37.6%,55.2%, 41.1%。可见24h的p38MAPK磷酸化水平最高,因此认为该时间点为p38MAPK最高大磷酸化时间点。②EGF对SEG-1细胞u-PA mRNA和蛋白表达的影响:应用RT-PCR方法检测u-PA mRNA表达,结果显示人食管腺癌细胞(SEG-1)中有u-PA基因表达,随着EGF作用时间的延长,u-PA mRNA的表达水平逐渐上升:EGF作用于SEG-1细胞1h后u-PA mRNA表达为:0.265±0.057,与对照组(0.259±0.064)相比,p>0.05,无统计学意义;EGF作用于SEG-1细胞6h后,u-PA mRNA表达为0.306±0.061,与对照组(0.259±0.064)相比,u-PA mRNA表达升高,有统计学意义(p<0.05);EGF作用于SEG-1细胞12h、24h、48h后u-PA mRNA分别表达为:0.642±0.049,0.894±0.045,0.725±0.051,与对照组(0.259±0.064)相比,u-PA mRNA表达明显升高,有统计学意义(p<0.01)。可见本实验中u-PA mRNA表达随EGF作用时间逐渐升高,于24h达高峰,后又逐渐下降。Westem blot方法检测u-PA蛋白表达,结果显示EGF刺激前SEG-1细胞u-PA蛋白表达量较低,刺激后6h开始上升,持续至24h达最高,后又逐渐下降,呈明显的时间依赖性。EGF作用于SEG-1细胞1h后u-PA蛋白表达为0.291±0.063,与对照组(0.288±0.036)比较,p>0.05,无统计学意义。作用6h后u-PA蛋白表达为0.458±0.069与对照组(0.288±0.036)比较,表达升高,p<0.05,有统计学意义。作用12h、24h、48h后,u-PA蛋白表达为0.705±0.056、0.0845±0.049、0.756±0.042,与对照组(0.288±0.036)比较,表达明显升高,p<0.01,有统计学意义。③p38MAPK特异抑制剂SB203580可明显抑制EGF诱导的p38MAPK激酶活力,对EGF诱导的SEG-1细胞内u-PA mRNA和蛋白的表达亦有明显的抑制作用。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L SB203580与EGF同时作用与细胞后p38MAPK磷酸化的百分比分别为36.2%,19.3%,7.1%,明显低于EGF组p38MAPK磷酸化的百分值51.4%。SB203580(5μmol/L)+EGF组、SB203580(10μmol/L)+EGF组u-PA mRNA表达分别为0.718±0.029,0.607±0.047,与EGF组0.853±0.034相比,p<0.05,表达下降,有统计学意义。EGF+ SB203580(20μmol/L)组表达量为0.313±0.034与EGF组0.853±0.034相比,p<0.01,表达明显下降,有统计学意义SB203580(5μmol/L)+EGF组、SB203580(10μmol/L)+EGF组u-PA蛋白表达分别为0.708±0.048,0.654±0.052,与EGF组0.805±0.042相比,p<0.05,表达下降,有统计学意义。SB203580(20μmol/L)+EGF组表达量为0.303±0.045与EGF组0.805±0.042相比,p<0.01,表达明显下降,有统计学意义。结论:①EGF可引起p38MAPK蛋白磷酸化,在相同浓度EGF(100ng/ml)作用下,p38MAPK蛋白的磷酸化呈时间依赖性,最大磷酸化的作用时间点为24h。②相同浓度EGF(100ng/ml)可引起SEG-1细胞u-PA mRNA和蛋白表达增加,并呈明显的时间依赖性,其表达于24h达高峰。③SB203580可明显抑制SEG-1细胞p38MAPK蛋白的磷酸化;用其阻断p38MAPK信号转导通路后,EGF对u-PA的诱导作用受到明显抑制,并且具有剂量依赖性。