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单颗粒病毒示踪技术,使得研究人员可以实时观测毒感染细胞的动态过程,追踪病毒粒子与细胞各组分的相互作用,直观且真实地反映病毒的感染细节,对研究病毒的感染机制具有重大的意义和作用。 单颗粒病毒示踪的前提是将适当的荧光材料有效地标记于病毒颗粒上。用于病毒标记的常规荧光材料,由于存在荧光强度较弱,稳定性较差,易受光漂白等缺点,无法清晰、准确且长时间地示踪病毒的感染过程,使得病毒的动态示踪研究受到了限制。量子点作为一种光学性质优越的新型荧光材料,成功克服了以上缺点,因此被越来越广泛地运用于病毒的标记与示踪研究。 量子点标记病毒颗粒的技术已经受到了广泛关注。通过修饰及改造病毒颗粒的表面蛋白,带有相应功能基团的量子点可以被成功地标记在病毒颗粒上,并用于其感染细胞过程的实时示踪。但值得注意的是,病毒的表面蛋白,尤其是有囊膜病毒的囊膜蛋白,在病毒颗粒与细胞表面相互识别,吸附和结合的过程中有着不可取代的重要作用。量子点标记在病毒表面以及为了标记而对病毒表面蛋白进行的修饰和改造,有可能占据或更改了病毒颗粒与细胞的结合位点,因此极有可能会影响病毒与细胞的结合过程,从而降低病毒的感染效率,甚至改变病毒与细胞的相互作用方式,造成不真实的示踪结果。 将量子点包装于病毒颗粒内部的标记策略,由于不需要对病毒表面进行任何修饰与更改,所以有效避免了以上问题。但已报道的包装方法,均是通过病毒结构蛋白的体外自组装原理包裹量子点。由于有囊膜病毒必须在病毒粒子出芽及释放过程中从宿主细胞上获得囊膜,这种体外包装策略并不适用于有囊膜病毒。因此,亟需发展一种将量子点包装在囊膜病毒内部的标记方法来促进病毒感染示踪的研究。 为了实现有囊膜病毒包装量子点,本研究提出了一种新型的包装策略。 我们以HIV-1慢病毒载体系统为平台,在活细胞内共转染了慢病毒载体系统中的包装质粒,囊膜蛋白表达质粒,以及RNA-量子点复合物。其中包装质粒编码HIV-1的结构蛋白Gag及GagPol,囊膜蛋白表达质粒编码一种外源囊膜蛋白—水疱性口炎病毒G蛋白,而与量子点相连的RNA因为含有HIV-1病毒基因组包装所必须的包装信号(packaging signal,Psi)等元件,所以能够在病毒胞内组装的过程中与病毒结构蛋白Gag相互作用,从而携带量子点一起被包裹进病毒颗粒内部并形成成熟的病毒颗粒,产生包装了量子点的假型慢病毒。 实验证实,量子点能有效地被包裹进病毒颗粒内部,并可以随着病毒颗粒的感染高效地进入细胞,且这种包装并未影响到病毒颗粒的形态学特征以及量子点本身的光学特征。 理论上,这种包装量子点标记策略,因为不需要对病毒颗粒的表面蛋白进行任何修饰与改造,所以不会影响到病毒进入细胞的效率。为了证实这个推测,我们利用实时荧光定量PCR实验,比较了相同滴度的包装了量子点的假型慢病毒与未标记假型慢病毒的细胞进入效率,结果发现,两者的进入效率几乎相等,证实了我们所提出的量子点包装策略不会影响病毒颗粒的入侵效率。 此外,我们也对包装了量子点的假型慢病毒颗粒进行了示踪,发现量子点信号可以高效地进入到Rab5+内吞体中,并沿着微管运动到微管形成中心。这些结果与之前文献所报道的水疱口炎病毒,或者带有水疱口炎病毒G蛋白的假型慢病毒的感染机制一致,说明我们的量子点标记策略并未改变病毒的感染方式,同时也证实此标记方法可对有囊膜病毒的感染过程进行有效示踪。 总言之,本实验提出了一种能使有囊膜病毒在活细胞内包装量子点的新型标记策略,并验证了此策略的可行性,这种标记策略对病毒颗粒的形态学特征,入侵细胞的效率以及量子点本身的光学性质都不会产生影响。是一种适用于单颗粒病毒示踪的良好标记策略,为病毒感染机制的深入研究奠定了方法学基础。